предметів

реферат

Адипонектин відіграє ключову роль у регуляції енергетичного гомеостазу всього організму шляхом модуляції метаболізму глюкози та ліпідів. Хоча зменшення експресії адипонектину, спричинене ожирінням, головним чином пояснюється порушенням регуляції транскрипції, основні механізми в основному не визначені. Тут ми показали, що гіперметилювання ДНК певної області промотору адипонектину пригнічує експресію адипонектину за допомогою епігенетичного контролю і згодом посилює метаболічні захворювання при ожирінні. Індуковані ожирінням протизапальні цитокіни сприяють експресії DNMT1 та ферментативній активності. Активований DNMT1 вибірково метилює та стимулює компактну структуру хроматину в промоторі адипонектину, що перешкоджає експресії адипонектину. Придушення активності DNMT1 інгібітором DNMT призвело до поліпшення індукованої ожирінням непереносимості глюкози та резистентності до інсуліну залежно від адипонектину. Ці висновки свідчать про вирішальну роль епігенетичного контролю гена адипонектину за допомогою DNMT1 в управлінні енергетичним гомеостазом, припускаючи, що модуляція активності DNMT1 представляє нову стратегію лікування захворювань, пов’язаних з ожирінням.

Епігенетична регуляція, включаючи метилювання ДНК, є одним із ключових механізмів регулювання експресії еукаріотичних генів без модифікації послідовності ДНК 1. Накопичення доказів показало, що метилювання ДНК послужить мостом між змінами навколишнього середовища та клітинними реакціями. Примітно, що поживний статус по-різному модулює метилювання ДНК в декількох метаболічних генах, включаючи гепатоцитарний ядерний фактор 4α, панкреатичний та дуоденальний гомеобокс 1 (Pdx1), активований проліфератором пероксисом рецептор (Ppar) y коактиватор -1 α (Pgc-1 α) 2, 3 4, 5. Цікаво, що кілька звітів показали, що споживання дієт з високим вмістом жиру (HFD) впливає на епігенетику різних генів, що беруть участь у спадкуванні метаболічного дисбалансу наступного покоління, пов'язаного з чутливістю до інсуліну 6, 7 .

Адипонектин, який вибірково експресується в адипоцитах, модулює енергетичний гомеостаз у всьому тілі, регулюючи обмін глюкози та ліпідів 8, 9. У метаболічних тканинах адипонектин підвищує чутливість до інсуліну, сприяючи утилізації глюкози та окисленню жирних кислот 9, 10. Крім того, адипонектин пригнічує імунну відповідь, спричинену ожирінням та розвитком атерогенних факторів ризику 11, 12. Таким чином, добавка адипонектину або агоніста рецептора адипонектину покращує чутливість до інсуліну та метаболічні параметри у тварин із ожирінням 13, 14. Цікаво, що експресія адипонектину та рівень сироватки крові негативно корелюють із метаболічними захворюваннями, пов’язаними із ожирінням та ожирінням, такими як резистентність до інсуліну, діабет 2 типу та серцево-судинні захворювання15.

Взагалі, експресія адипонектину контролюється на декількох етапах регулювання, таких як транскрипційна та посттрансляційна регуляція, включаючи олігомерне розташування та секрецію. При ожирінні такий регуляторний механізм адипонектину порушується кількома факторами, включаючи гіпертрофію адипоцитів, запалення та окислювальний стрес, що призводить до гіпоадіпонектинемії 15, 16, 17. Серед них все більше свідчень свідчить про те, що гіпоадіпонектинемія при ожирінні в першу чергу пояснюється порушенням транскрипції . 19. Важливо, що основний молекулярний механізм, який опосередковує таку дисрегуляцію при ожирінні, не з’ясований. Зокрема, не досліджено, чи епігенетичні зміни, такі як метилювання ДНК, відіграють роль у порушення регуляції експресії гена адипонектину при ожирінні.

У цьому дослідженні ми досліджували роль метилювання ДНК у експресії гена адипонектину. Ми виявили, що гіперметилювання промотору адипонектину пригнічує транскрипцію адипонектину. Крім того, метилювання ДНК в промоторі адипонектину опосередковується ДНК-метилтрансферазою (DNMT) 1, експресія якої збільшується в адипоцитах у осіб із ожирінням. Крім того, стимуляція експресії адипонектину шляхом придушення активності DNMT1 пригнічувала запальні реакції та підвищувала чутливість до інсуліну у мишей із ожирінням, що дало б нове розуміння механізмів, що підтримують перепрограмування експресії гена адипонектину шляхом метилювання ДНК при метаболічних ускладненнях.

результат

Промотор адипонектину гіперметильований у осіб із ожирінням

Відповідно до попередніх повідомлень 15, 18, 19, рівні мРНК адипонектину значно знижувались в адипоцитах у мишей із ожирінням, яких годували HFD, тоді як рівні мРНК ключових факторів транскрипції, що регулюють адипонектин, включаючи Ppary2 або CCAAT/зв'язуючий енхансер білок a (C/ebp) ) не зазнали суттєвих змін (додатковий малюнок 1а). Це спостереження привело нас до роздумів про можливість альтернативних шляхів, задіяних у транскрипційній репресії адипонектину при ожирінні. Серед різних біологічних процесів метилювання ДНК є одним із ключових регуляторних механізмів транскрипції, який контролює доступ механізму транскрипції до мішеней через модуляцію структури хроматину 20. Крім того, нещодавні результати показали, що метилювання ДНК є активним регуляторним механізмом, що реагує на зміни харчових міток, що має численні ефекти на регуляцію системного енергетичного гомеостазу 2, 3, 4, 5, 6, 7 .

гіперметилювання

Диференційовані адипоцити 3T3-L1 інкубували з TNFα (10 нг мл-1) або IL-1β (10 нг мл-1) протягом 24 годин або без. ( a, b ) рівні мРНК адипонектину, Dnmt1 та Mcp-1. ( c ) відносна ферментативна активність ДНМТ. ( d, e ) Аналіз послідовності бісульфіту R2 та кількісна оцінка 5-мС. ( f ) Тест доступності ферментного обмеження. Рівні мРНК вимірювали за допомогою qPCR. ( g ) R2 ChIP-аналіз. Результати виражаються як середнє значення ± 3 незалежних вибірки (n = 3). Подібні результати були отримані, принаймні, понад трьома незалежними експериментами. * P

Мишам db/db або адипонектину та рецептору лептину DKO вводили носій (1% DMSO; Veh, n = 4-5) або RG108 (n = 4-5). ( a ) Рівні адипонектину в сироватці крові визначали методом ІФА. b ) Рівень глюкози та інсуліну натще. c ) рівень ТГ у сироватці крові. d ) OGTT. Після голодування протягом 16 годин мишам вводили внутрішньочеревно 1 г кг-1 маси тіла глюкози та контролювали рівень глюкози в крові. Представлені часові курси очищення крові та AUC. ( e ) Рівні мРНК запального гена досліджували в eWAT. Рівні мРНК вимірювали за допомогою qPCR. ( f ) Гістологічний аналіз печінки (фарбування H&E). Шкала, 50 мкм. g ) Вміст печінкового ТГ. Результати виражаються як середнє значення ± sem * P

При ожирінні підвищений DNMT1 індукує гіперметилювання ДНК у певній області (R2) промотору адипонектину, що призводить до пригнічення експресії гена адипонектину в адипоцитах.

Повнорозмірне зображення

Оскільки жирова тканина одночасно стикається з взаємопов’язаними метаболічними ускладненнями, включаючи хронічне запалення, стрес ендоплазматичного ретикулума, дисфункцію мітохондрій та гіпоксію при ожирінні 31, 32, ми дослідили, які фактори відіграють вирішальну роль у придушенні експресії гена адипонектину в адипоцитах, опосередкованих DNMT1. запальні сигнали, такі як TNFα та IL-1β, стимулювали експресію/активність DNMT1 та покращували метилювання ДНК у R2 в адипоцитах, що пригнічує експресію адипонектину. З іншого боку, гостре лікування тунікаміцином, ротеноном або гіпоксією сильно пригнічувало експресію гена адипонектину незалежно від експресії DNMT1 та подальшого метилювання ДНК. Однак ці патофізіологічні стани поділяють багато гравців та точки перехресного слуху, що в кінцевому підсумку призводить до порушення регуляції жирової тканини31. Таким чином, індуковане ожирінням гіперметилювання R2 in vivo є більш вірогідним через накопичення прозапальних реакцій кількома факторами, що впливають на порушення регуляції жирової тканини.

У цьому дослідженні ми виявили декількох кандидатів, пов'язаних або з R2, або з R2-зв'язаними білками у відповідь на прозапальну стимуляцію. Спостерігалося збільшення зв’язування певних типів транскрипційних регуляторних білків, що беруть участь у модифікації гістонів на R2. Наприклад, відомо, що фактор сплайсингу фактора, багатого на пролін і глутамін (SFPQ), і дельта-3-подібна лібіза убиквітину (DTX3L), які були зв’язані з R2 на TNFα, беруть участь у репресії транскрипції та переробці хроматину 33, 34 . Крім того, як припускають подальші звіти 35, 36, 37, DNMT1 має здатність метилювати селективні послідовності ДНК шляхом утворення комплексів із специфічними факторами транскрипції. Таким чином, цілком ймовірно, що DNMT1 призводить до R2, взаємодіючи з певними факторами транскрипції, зв'язування яких з R2 може бути змінено ожирінням. Тому, очевидно, важливо з’ясувати роль цих нещодавно виявлених білків у опосередкованому ожирінням супресії адипонектину в наступних дослідженнях.

Попередні дослідження стосувались кореляції між поліморфізмами однонуклеотидних адипонектинів людини (SNP) та рівнями адипонектину в сироватці крові 38, 39, 40, 41, 42. Цікаво, що два SNP (rs17300539 та rs266729), які демонструють значну кореляцію з рівнями адипонектину в сироватці крові 43, 44, 45, 46, знаходяться в R2 промотору людського адипонектину і можуть служити динуклеотидами CpG, оскільки C є переднім положенням кожен SNP (додаткова фігура 2). Наприклад, люди, що мають заміну від G до A (генотип rs17300539 A/A), демонструють вищі рівні адипонектину в плазмі, ніж особи з генотипом rs17300539 G/G. Аналогічно, люди, що мають заміщення від C до G (rs266729 G/G генотип) нижчі концентрації адипонектину в плазмі порівняно з особами з генотипом С/С. Отже, наші висновки та дані SNP людини настійно підтримують критичну роль гіперметилювання ДНК у придушенні експресії адипонектину.

Загалом, це дослідження ілюструє одну з ключових регуляторних областей у гені адипонектину, модифікація ДНК та ремоделювання хроматину важливі для придушення експресії адипонектину, спричиненої ожирінням. Зокрема, ці дані демонструють доцільність стимулювання експресії адипонектину інгібітором DNMT для потенційних терапевтичних засобів проти захворювань, пов’язаних із ожирінням.

методи

Експерименти на тваринах

Вимірювання сироваткових білків та ліпідів

Рівні інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) (Shibayagi Co. Ltd., AKRIN-001T). Активність аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази в сироватці крові вимірювали за допомогою набору для аналізу активності (Biovision, K752-100, K753-100 та Sigma Aldrich, MAK052-1KT, MAK055-1KT). Набори для аналізу використовували для вимірювання TG у сироватці крові (Thermo Fischer Scientific Inc., TR22321 та Sigma Aldrich, T2449-10ML) та FFA (Roche, 11,383,174,001). Рівні адипонектину в сироватці крові вимірювали за допомогою домашнього набору ІФА (Університет Гонконгу). Аналіз та кількісне визначення олігомеризації адипонектину проводили за допомогою гель-фільтрації, як описано вище 47. Коротко, 10 мкл сироватки розбавляли 1 мл PBS. Розведені сироватки наносили на систему хроматографів з флеш-білком AKTA explorer, фракціонували на колонці Hiload 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, 28-9893-35) і елюювали PBS зі швидкістю потоку 1 мл хв-1. Кожну фракцію 0,5 мл збирали і піддавали аналізу ELISA.

Зразки людини

Зразки жирової тканини людини були отримані у 12 суб'єктів з Центру досліджень ожиріння Медичного коледжу університету короля Сауда, Ер-Ріяд, Саудівська Аравія. Протокол був схвалений Комітетом з етики медичного коледжу Університету короля Сауда, а також отримана письмова інформована згода всіх учасників на участь у дослідженні. Після фракціонування адипоцитів та екстракції геномної ДНК рівні метилювання промотору адипонектину в області R2 аналізували методом бісульфітного секвенування. Після екстракції РНК РНК була зворотно транскрибована в комплементарну ДНК (кДНК), а потім використана для кількісної ПЛР у реальному часі (qPCR).

Фракціонування жирової тканини та проточна цитометрія

Очищення геномної ДНК та послідовності бісульфітів

ДНК очищали екстракцією фенолом та хлороформом. Клітини лізували протягом 1 год у буфері для лізису (50 мМ Tris-Cl (рН 8,0), 50 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA; рН 8,0), 100 мМ NaCl, 2% SDS і 20 мкг мл-1 РНКази) при 37 ° C. і перетравлювали 10 мкг мл-1 протеїнази К протягом 3 годин при 50 ° C. Конверсію бісульфіту проводили за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, 59104). Перетворену ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР, використовуючи праймери, розроблені з програмним забезпеченням Methprimer (www.urogene.org/methprimer/index1.html). Умови ПЛР становили 95 ° С протягом 7 хвилин і 35 циклів при 95 ° С протягом 1 хв, 55 ° С 30 і 72 ° С протягом 1 хв, а потім 10 хв при 72 ° С. Продукти ПЛР, клоновані в бактерії за допомогою TOPO TA набір для клонування (Invitrogen, 450641). Вісім клонів для кожного зразка секвенували за допомогою комерційних послуг COSMO Genetech. Послідовності праймерів, які використовували для ПЛР, перелічені в Додатковій таблиці 2.

Культура клітин та транзиторна трансфекція

Клітини 3T3-L1 отримували з ATCC (CL-173). Клітини 3T3-L1 вирощували до місця злиття в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (DMEM; Hyclone, SH30243.01), доповненому 10% бичачою телячою сироваткою (Gibco, 26010-074). Щоб викликати диференціювання адипоцитів, клітини 3T3-L1 інкубували з DMEM, що містить 10% плодової бичачої сироватки (FBS; Hyclone, SH30919.03), 0,55 мМ 3-ізобутил-1-метилксантину (Sigma Aldrich, I5879) через 2 дні після злиття. дексаметазон (Sigma Aldrich, D1756) та 1 мкг мл-1 інсуліну (Roche, 11 376 497 001) протягом 2 днів. Потім культуральне середовище замінювали DMEM, що містить 10% FBS і 1 мкг мл-1 інсуліну, і клітини культивували ще 2 дні. Живильне середовище змінювали кожні 2 дні за допомогою DMEM, що містить 10% FBS.

Невеликі дуплекси РНК, що заважають, були розроблені та придбані у Bioneer (DNMT1, 1350629; DNMT3a, 1350650). Вектор pcDNA3-DNMT1 люб’язно подарував доктор Франсуа Фукс (Вільний університет Брюсселя, Бельгія). Кожна невелика заважаюча РНК (20 мкМ), pcDNA3.1-myc-His та pcDNA3.1-DNMT1 доставлялися до клітин 3T3-L1 за допомогою мікропоратора (Digital Bio Technology Co. Ltd.).

У різних патологічних експериментах, що імітують навколишнє середовище, диференційовані адипоцити 3T3-L1 інкубували з 10 нг мл-1 TNFα або без нього (R&D Systems, 210-TA), 10 нг мл-1 IL-1β (R&D Systems, 201-LB) 1 мкг мл-1 тунікаміцину (Calbiochem, 654080), 1 мкМ ротенону (Sigma Aldrich, R8875) або інкубують у нормальних або гіпоксичних умовах (1% концентрація O 2) протягом 24 годин. Для пригнічення активності DNMT1, адипоцити 3T3-L1 попередньо інкубували з RG108 (100 мкМ) за 24 години до лікування TNFα.

Виділення РНК та qPCR

Процедуру виділення РНК та синтезу кДНК проводили, як описано раніше. Коротко кажучи, загальну РНК виділяли з клітин мишей або клітинних ліній за допомогою реагенту TRIzol (Ambion, 15596-018) і піддавали синтезу кДНК, використовуючи набір синтезу cPNA Maxima First Strand для qPCR (Thermo Scientific, K1642). РНК з очищених людських адипоцитів екстрагували за допомогою набору RNeasy Lipid Tissue Kit (Qiagen, 74804) і піддавали синтезу кДНК, використовуючи набір РНК-кДНК високої ємності (Applied Biosystems, 4387406). Відносні рівні мРНК вимірювали за допомогою системи реального часу CFX96 (Bio-Rad Laboratories Inc.) та обчислювали нормалізацією до рівня мРНК циклофіліну (клітини миші або клітинні лінії) або рівня мРНК GAPDH (клітини людини). Послідовності праймерів, що використовуються для кількісного аналізу ПЛР у реальному часі, перелічені в Додатковій таблиці 3.

Тест доступності ферментного обмеження

Аналіз доступності ферменту обмеження був описаний раніше 50. Коротко, адипоцити жирової тканини епідидиму та клітини 3T3-L1 збирали буфером RSB (10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 0,1% Нонідет Р-40 (NP-40), 5 мМ бутират, 10 мМ NaF та 1 мМ NaVO 7, доповнений інгібіторами протеази) та інкубували протягом 20 хвилин на льоду. Клітинні гранули гомогенізували за допомогою шприців 27 г, центрифугували при 2000 об/хв при 4 ° С протягом 5 хвилин і ресуспендували в 100 мкл свіжого буфера RSB. Ресуспендовану гДНК розщеплювали 100 U AluI, EcoRI та BamHI (TaKaRa, 1004A, 1040A та 1010A). Реакції зупиняли додаванням протеїнази К і 2% SDS протягом 6 годин при 45 ° C. Хромосомну ДНК двічі екстрагували фенол-хлороформом, осаджували ізопропанолом і ресуспендували в дистильованій воді. Обложену ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР. Відносні кількості продукту ПЛР вимірювали за допомогою системи реального часу CFX96 (Bio-Rad Laboratories Inc.) Послідовності праймерів, які використовували для ПЛР, наведені в додатковій таблиці 2.

Імунопреципітація хроматину

Вестерн-блот

Аналіз ферментативної активності DNMT

Для очищення ядерних екстрактів клітини збирали в гіпотонічний буфер (50 мМ KCl, 25 мМ HEPES (рН 7,8), коктейль інгібітора протеази (GeneDEPOT, P3100)) з 0,5% NP-40. Зібрані клітини інкубували на льоду протягом 10 хв і двічі промивали гіпотонічним буфером без NP-40. Після видалення надосадової рідини гранули ресуспендували за допомогою буфера для екстракції ядер (500 мМ KCl, 10% гліцерину, 25 мМ HEPES (рН 7,8), коктейль інгібітора протеази) та інкубували протягом 5 хв. Супернатант збирали для оцінки ядерного білка після центрифугування. Аналіз ферментативної активності DNMT проводили за допомогою набору для аналізу активності/інгібування ДНК-метилтрансферази EpiQuik (Epigentek Group Inc., P-3001) з ядерним екстрактом.

Очищення та характеристика R2-зв’язуючого білка

Статистичний аналіз

Усі результати представлені як середнє значення ± sem Статистичну значимість оцінювали двостороннім t-тестом Стьюдента за допомогою GraphPad Prism 5.0 (програмне забезпечення GraphPad). Не було різниці у дисперсіях для всіх порівнянь у F-тесті. Коли клітини використовували для експериментів, було обрано три повторення на групу. Усі значення n, визначені в легендах, стосуються біологічних копій, якщо не вказано інше. У експериментах на мишах, що вимагали технічних маніпуляцій, використовували принаймні п’ять мишей на групу. Якщо виникали технічні збої, такі як відмова ротової порожнини матки та інтраперитонеальна ін’єкція, ці зразки виключали з остаточного аналізу. Відмінності вважали статистично значущими для Р