предметів
реферат
Головний
Більшість жінок з діагнозом рак яєчників, які лікуються за стандартними протоколами, помирають від своєї хвороби1, і за останні два десятиліття спостерігається мінімальне покращення результатів. Досягнутий прогрес у вдосконаленні морфологічних критеріїв для підтипу раку яєчників, і нещодавно діагностична відтворюваність була підвищена до відмінного рівня відтворюваності. 5, 5 5 основних підтипів раку яєчників (серозний, прозорий, ендометріоїдний, муцинозний та серозний), які можна ідентифікувати на основі морфологічних критеріїв, різняться залежно від генетичних факторів ризику, уражень попередників, молекулярних змін на стадії представлення та клінічну поведінку, 3, 5, 6, 7 і найкраще розглядати як різні сутності захворювання. Через різницю в хіміочутливості між підтипами раку яєчників, існує потреба у проведенні специфічних для підтипів клінічних випробувань з метою виявлення більш ефективних методів лікування цих підтипів (тобто прозорих клітин, муцинозних), стійких до звичайної хіміотерапії платиною/таксаном. 9, 10, 11
Нещодавно було показано, що неоад’ювантна хіміотерапія, яка супроводжується хірургічним втручанням, дає подібні результати, як післяопераційна хіміотерапія у пацієнтів із запущеним раком яєчників з перевагою зменшення захворюваності, скорочення часу операції та швидшого післяопераційного відновлення. Неоад’ювантна хіміотерапія ефективна при високосерозному раку, але не для інших. Коли неоад’ювантна хіміотерапія проводиться лише для певного підтипу раку яєчників, це викликає питання про те, наскільки надійно підтип можна діагностувати на обмежених зразках, таких як зразки ядерної біопсії або біопсія тонкої голки. Хоча відмінна відтворюваність можлива, коли діагноз ґрунтується на дослідженні множинних предметних стекол з добре зібраної пухлини, 4 немає доказів того, що подібна відтворюваність можлива на основі невеликої зразки пухлини. Нещодавно ми показали, що основні підтипи раку яєчників суттєво відрізняються за своїм профілем експресії біомаркерів 8, припускаючи, що експресія біомаркерів може бути корисною для діагностики підтипів. Тому ми шукали найменшу панель імуногістохімічних біомаркерів, яка показала найвищу чутливість та специфічність для діагностики п’яти основних підтипів раку яєчників.
Матеріали і методи
Етичне твердження
Схвалення на використання цих груп для цього дослідження було отримано від Дослідницької ради з питань етики Британської Колумбійської агенції раку та Університету Британської Колумбії.
Навчальні групи та критерії включення
У цьому дослідженні використовуються три незалежні когорти, дві для генерації прогнозних рівнянь і одна для перевірки цих прогнозних рівнянь (рис. 1).
Експериментальна конструкція дослідження детально описує незалежне відкриття імуногістохімічної групи маркерів з двох не пов’язаних когорт, точність прогнозування, представлене статистичним значенням κ (κ) та внутрішнє підтвердження.
Повнорозмірне зображення
Перша когорта, надалі іменована архівною когортою, містила загалом 500 зафіксованих у формаліні парафінових тканин карциноми яєчників із раніше описаної ретроспективної когорти на основі популяції Британської Колумбії, діагностованої між 1984 та 2000 рр. Ці зразки були з> 20 Британської Колумбії лікарні., без стандартизації фіксації або обробки зразків. Основним критерієм прийнятності був діагноз хемонічного раку яєчників, коли пацієнти були позбавлені макроскопічного залишкового захворювання після первинної циторедукційної хірургії, що не призвело до макроскопічного залишкового захворювання. Це визначення випадку призвело до відносно великої кількості несерозних ракових захворювань порівняно з тим, що очікується від серії, що включає всіх хворих на рак яєчників. 6
Друга група, що далі називається когортами банків пухлин, складалася з одного набору госпітальних банків гінекологічних банків тканин загальної лікарні Ванкувера і складалася з 292 зразків пацієнтів з діагнозом рак яєчників між 2001 і 2008 роками. Ці зразки представляють якісну тканину з короткий час девіталізації та стандартизована фіксація та обробка тканин.
Третя група, надалі іменована когортою валідації, складалася з поступово діагностованих випадків раку яєчників, що спостерігались у п'яти центрах Канади, і включала зразки, відібрані з 2006 по 2009 рік, які були частиною недавнього гістоморфологічного дослідження. 4
Класифікація пухлин
Всі гістологічні предметні стекла були патологічно досліджені (CBG та MK) та призначені одному з п’яти основних підтипів (серозний, прозорий, ендометріоїдний, муцинозний, серозний, серозний) або іншим (включаючи змішані ракові захворювання та рідкісні типи, такі як недиференційована, сквамозна, злоякісна пухлина Бреннера, некласифікований) відповідно до модифікованих критеріїв ВООЗ, як нещодавно описано. 3, 7 Карциноми з перехідною моделлю зростання при обстеженні з низьким рівнем потужності, але інші особливості високоякісної сироваткової карциноми, такі як щілини або мікрокістоз, були класифіковані як варіант високоякісної серозної карциноми, тобто. серозна карцинома (з тимчасовими ознаками). Усі випадки, діагностовані як «інші» (тобто не один із п’яти основних підтипів раку яєчників), були виключені з цього дослідження. Крім того, між двома оцінюючими патологоанатомами була необхідна згода між спостерігачами щодо діагнозу гістологічного підтипу. Виключено випадки невиконання (N = 98 із 873 справ із трьох серій (11, 2%)). Нарешті, статистичному аналізу піддавали лише випадки, коли були доступні повні дані для всіх імунозалежних речовин (N = 138 із 775 (17,8%) не мали повних даних для всіх 22 маркерів і були виключені).
Вибір марки
імуногістохімія
Три тканинні мікрочипи були побудовані, як описано вище 13, з репрезентативних областей пухлини з використанням тканинного масиву (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, США та Pathology Devices, Westminster, MD, USA). З кожного донорського блоку виймали два ядра діаметром 0,6 мм і передавали їх у блок-реципієнт.
Зрізи товщиною 4 мкм вирізали і фарбували протягом 2 тижнів після різання. Деталі антитіл із остаточного набору з дев’яти маркерів та процедур фарбування наведені в таблиці 1. Незалежно від цього, два патологоанатоми (MK або BG) візуально оцінили ці біомаркери з оцифрованих зображень (сканер BLISS, Bacus Laboratories/Olympus America, Lombard, IL, USA ). Усі біомаркери оцінювали як позитивні чи негативні, використовуючи позитивний відсік> 1% клітин (рис. 2), за винятком CDKN2A, для якого позитивним фарбуванням було визначено> 75% пухлинних клітин, що демонструють сильне цитоплазматичне та ядерне фарбування як визначений. раніше, 24 та TP53, де застосовувалася триступенева система підрахунку балів (повна відсутність - оцінка 0, 1-50% - оцінка 1 та> 50% - оцінка 2) через докази того, що оцінки 2 та 0 корелюють з базовими мутаціями, в той час як оцінка 1 корелює з диким типом TP53 25 (рисунок 3). Менше 5% випадків показали суперечливі результати між двома скоринговими патологами, і для цих випадків використовувались вищі бали.
Стіл в натуральну величину
Репрезентативні імунозабарвлені речовини для DKK1, HNF1B, MDM2, PGR, TFF3, VIM, WT1. Відсікання між негативним (бал 0) та позитивним (бал 1) позначено товстою вертикальною лінією.
Повнорозмірне зображення
Репрезентативні імунозахисні речовини для CDKN2A та TP53. Порізи позначаються товстою лінією. Для CDKN2A оцінка 0 - це негативне або слабке позитивне фарбування, тоді як сильне позитивне фарбування - оцінка 1. TP53 оцінювали за допомогою системи складання балів із трьох частин: 0-негативна, 1-слабка позитивна, 2-позитивна. Детальніше про оцінку див. У матеріалах та методах.
Повнорозмірне зображення
Статистичний аналіз
Резервний аналіз та статистика Пірсона 2 (з некорегованими значеннями Р) використовувались для тестування гетерогенності експресії для кожного біомаркеру між архівом та когортами пухлини в межах кожного підтипу. Моделювання логотипу реальної регресії за допомогою модельної моделі було використано для створення прогнозуючих рівнянь, які починаються на всій панелі з 22 маркерів. Критерій виключення для конкретного маркера базувався на найвищому значенні Р у тесті коефіцієнта ймовірності. Для модельних прогнозів характеристична площа приймача приймача під кривою (AUC)> 0,95 була визначена як бажаний результат для кожного гістологічного типу для цілей цього дослідження.
Валідація прогнозних рівнянь проводилась шляхом застосування остаточної імуногістохімічної панелі до когорти валідації для створення прогнозованих гістологічних підтипів, які можна порівняти з консенсусом гістопатологічного підтипу. Підтип, який модель вважає найбільш вірогідним, навіть якщо ймовірність була 27
результат
Основні клінічні параметри та морфологічно оцінені підтипи діагнозів для архівів, банків пухлин та файлів перевірки наведені в таблиці 2. Через необхідність інтерпретованого результату фарбування для всіх 22 імуномаркерів, остаточні цифри для формування рівняння прогнозування 314 були для архівної групи і 242 для когорти банків пухлини. Не було різниці між включеними та виключеними випадками на основі частоти підтипу пухлини.
Стіл в натуральну величину
Як для архівних, так і для когортних банків пухлини, оригінальна панель із 22 маркерів, які були різницево виражені по підтипах раку яєчників, була піддана повній моделі, що поступово номінальною логістичною регресією використовувала зворотну елімінацію. Критерієм зупинки для процесу зворотної елімінації було забезпечення того, щоб робоча характеристика приймача під кривою (ROC AUC) становила ≥0,95 для кожного підтипу.Цей ітераційний процес забезпечував ту саму панель із дев'яти маркерів незалежно для когорт архіву та пухлини банки (рисунок 1). Обидва рівняння використовувались для прогнозування гістологічного підтипу у відповідних когортах, використовуючи чутливість, специфічність, робочу характеристику приймача під кривою (ROC AUC) та коефіцієнт Коена K (κ). Загалом, рівняння відмінно спрацювали з прогнозуванням призначень консенсусу підтипів як для архівних (κ = 0, 88 ± 0, 02), так і для банків пухлин (k = 0, 86 ± 0, 04) (Таблиці 3 та 4).
Стіл в натуральну величину
Стіл в натуральну величину
Точність низькосортного прогнозування перевіряли, застосовуючи обидва рівняння прогнозування до набору з 10 серозних прикордонних пухлин, і показали, що рівняння архівного прогнозу класифікує 9 із 10 випадків як низькосерійні сероти, один з яких класифікується як високий. - серозна сироватка, тоді як рівняння банків пухлин класифікувало 1 із 10 випадків як низькоякісну серозну карциному, 3 з 10 як серозну сироватку та 6 із 10 випадків як ендометрій. Ці результати змусили нас вивести рівняння прогнозування банку пухлини та створити нове рівняння прогнозування для цієї когорти, що базується лише на чотирьох підтипах (серозна, прозора клітина, ендометрій, муцинозна), тобто не намагатися розрізнити серозну хворобу та хворобу високого рівня . ступінь серозного. Це мало вплинуло на точність прогнозування для решти чотирьох підтипів (таблиця 5).
Стіл в натуральну величину
Потім моделі перехресно перевіряли щодо другої когорти (таблиця 6). Щоб визначити різницю між рівняннями прогнозування для архівної та пухлинної когорт, ми провели гістологічно специфічні тести гетерогенності для кожного маркера в когорті тесту та валідації. Це показало тенденцію до зниження антигенності в архівній групі порівняно з клінічною когортю і найкраще ілюструється, наприклад, частотою фарбування HNF1B в ендометріоїдних, прозорих клітинах та муцинозних підтипах (Таблиця 7). Навпаки, PGR у високому ступені серозного підтипу показав різні частоти фарбування у зворотному напрямку, причому 35, 8 та 19,1% випадків в архівах та групах банківських пухлин виражали PGR (P
Графіки логістичної регресії, що вказують на збільшення частки правильних клінічних діагнозів із підвищеною ймовірністю. ( a ) Архівний прогноз на архівну когорту, ( b ) прогнозування архівів у когорті банків пухлин, ( c ) прогнозування банку пухлини в архівній когорті, ( d ) прогноз банків пухлин для когорт пухлини, ( e ) прогнозування банку пухлини на когорті перевірки, ( f ) архівування прогнозів на когорту перевірки.
Повнорозмірне зображення
Ми дослідили профілі прогнозування для виключених випадків недиференційованого та некласифікованого раку. Обидва рівняння прогнозу класифікували 9 з 9 випадків недиференційованої карциноми як високоякісний серозний тип. П'ять випадків некласифікованої карциноми прогнозували як високосерозну серозну (3) та муцинозну (2) за допомогою рівняння архівного прогнозування та ендометріоїдного (2), високоякісного серозного (1) та муцинозного (2) прогнозування банків пухлин. рівняння. Усі чотири випадки серозної карциноми з тимчасовими функціями (як визначено у розділі «Матеріали та методи») були класифіковані як сильно серозні серйозно за обома рівняннями прогнозування.
обговорення
У цьому дослідженні ми розробили групу імуномаркерів, які можуть точно передбачити підтип раку яєчників. Цю маркерну панель легко застосувати на практиці, забезпечуючи об’єктивну молекулярну підтримку класифікації раку яєчників, тим самим посилюючи традиційну гістопатологічну класифікацію.
Типи раку яєчників різняться з точки зору попередників, клінічної поведінки, молекулярних змін та експресії біомаркерів. 7, 8 Що стосується раку молочної залози, де імуномаркери сприяють точному діагностуванню підтипів пухлини і можуть бути використані для керівництва у прийнятті терапевтичних рішень, також було запропоновано 28 конкретних видів лікування пухлини для раку яєчників. Наприклад, у жінок з діагнозом карциноми слизової оболонки або прозорих клітин хіміотерапія може бути неефективною, тоді як жінки з розвиненою високоякісною серозною карциномою можуть отримати користь від неоад'ювантної хіміотерапії. Інтеграція молекулярних знахідок у класифікацію раку яєчників може підвищити відтворюваність та точність діагнозу, що стане все більш важливим у майбутньому. Наприклад, при неоад'ювантній терапії, яка стане варіантом лікування при запущеному раку яєчників, перед лікуванням буде потрібно точне друкування основних біопсій або цитологічних зразків.
Сильні сторони дослідження включають використання двох великих незалежних когорт, одна з яких мала більшу частку підтипів меншості (прозорі клітини, ендометрій та муцинозні); ті самі дев'ять маркерних панелей були отримані від 22 авторів кандидатів самостійно в цих двох когортах. Також була використана третя незалежна когорта перевірки, що складається з випадків, що представляють частоту підтипів на практиці. 4, 6 Морфологічний "золотий стандарт", досягнутий шляхом відбору випадків, коли два спеціалісти-гінекологічні патологи самостійно узгоджували діагноз підтипу, забезпечував відповідність діагнозів у всіх трьох серіях випадків та максимально точну. Крім того, прагнучи забезпечити відтворюваність, ми обмежили наші маркери кандидатів IHC тими, де можна використовувати комерційно доступні антитіла та прості бальні системи.
Іншим обмеженням цього дослідження є відсутність здатності моделі пухлинного банку розрізняти низькоякісну серозну карциному та високоякісну серозну карциному. Низькоякісні сироваткові карциноми становлять 3% випадків раку яєчників6, що ускладнює отримання достатніх випадків для розробки моделі. Сироваткові карциноми з низькоякісною сироватковою карциномою у багатьох випадках походять від серозних прикордонних пухлин, а не від серозної бульбової внутрішньо-епітеліальної карциноми, не пов'язані з мутаціями зародкових ліній, мутаціями BRCA1/2 або мутаціями TP53, часто мають мутації BRAF або KRAS. не мають мутацій. вони також реагують на хіміотерапію на основі платини як високосерозну карциному. Хоча низькоякісні та високоякісні серотинові карциноми можна повторно діагностувати, коли для гістопатологічного дослідження доступні великі зразки тканин, різниця між низькоякісною та високоякісною серозною карциномою у невеликих зразках є проблематичною і необхідна подальша робота розвинена. біомаркери для допомоги у цій конкретній диференціальній діагностиці.
Знімок веб-калькулятора підтипу раку яєчників (COSP). COSP можна використовувати для того, що ми вважали "архівним" або "банком пухлин". Користувач сам визначає, яке рівняння найбільш підходить для їх зразків. COSP може використовуватися в одному режимі або як пакетний режим, що дозволяє аналізувати великі ретроспективні когорти мікрочипів тканин із даними, записаними у табличному форматі.
Повнорозмірне зображення
Складний типізатор, який відображає базову біологію пухлини та корелює з реакцією на терапію, допоможе поліпшити клінічне ведення у жінок з діагнозом рак яєчників.