фіброз

  • реферат
  • Головний
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Тварини та експериментальний дизайн
  • Активність каспази-3
  • Гістопатологічні та імуногістохімічні методи
  • Гібридизація на місці
  • Кількісна ПЛР в режимі реального часу
  • Вміст колагену в печінці
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Травма печінки
  • Збільшення клітин-попередників печінки
  • Фіброз печінки
  • Запалення печінки
  • Фіброгенні клітини печінки
  • EMT LPC
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткове зображення S1
  • Додаткове зображення S2

реферат

Головний

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини та експериментальний дизайн

Активність каспази-3

Лізати печінки готували гомогенізацією в гіпотонічному буфері (50 мМ HEPES pH 7, 5, 100 мМ NaCl, 1% NP40, 1 мМ EGTA рН 8, 1 мМ DTT, коктейль інгібітора протеази (Roche)). Гомогенати центрифугували при 10000 g протягом 15 хвилин, а витягнуті білки (50 мкг) аналізували в повторюваних експериментах шляхом вимірювання протеолітичного розщеплення флуорогенного субстрату Ac-DEVD-AFC на каспазі-3 (Biomol) на мікропланшеті TriStar LB 941 читач (Бертольд). як уже було описано. 30

Гістопатологічні та імуногістохімічні методи

Гібридизація in situ

Додатковий РНК-зонд, специфічний для α-фетопротеїну (AFP) і TGFβ, був синтезований за допомогою набору для мічення РНК дигоксигеніну (Roche Diagnostics). Зонди AFP CRNA отримували з плазміди кДНК щурів (подарованої д-ром JL Данан), розщепленої зондом Xma I (антисмисловий) або SphI (сенс) і транскрибованої з промоторів SP6 або T7. Зонди TGF β транскрибували з фрагмента кДНК, отриманого методом RT-PCR печінки печінки щурів на день 9, у моделі AAF/часткової гепатектомії, використовуючи прямий 5'-TACGTCAGACATTCGGGAAGCAGT-3 'та зворотний 5'-TGTACTGTGTGTCCAGGCTCCAAA-3' для нанесення на праймер. -576 та 1143-1131 β-послідовності щура TGF (GI: 148747597) і субклоновані в плазміду pCR4-TOPO. Зонди β-кРНК TGF транскрибували з промоторів T7 і T3 перетравленої Spe I (антисмислової) або NotI (чуттєвої) плазміди, а процедури мічення, гібридизації та виявлення проводили в парафінових зрізах, як описано вище. 31 Виявлення AFP або TGF β-мРНК у послідовних зрізах печінки, забарвлених імунофлуоресцентним анти-CK19, як описано вище, проводили із застосуванням стандартного протоколу гібридизації in situ на заморожених серійних зрізах, вирізаних товщиною 5 мкм (додаткові матеріали).

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Загальну РНК виділяли із замороженої тканини печінки за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen). Загалом 2 мкг було транскрибовано з випадкових гексамерів за допомогою першого набору синтезу ланцюгів (Fermentas Life Sciences), а специфічні ампліфікації кДНК проводили, як описано раніше 29, з використанням праймерів, перелічених у таблиці 1. Відносну кількісну оцінку експресії генів проводили з використанням Спосіб 2 - АКТ та нормалізація рибосомної 18S РНК та результати, виражені як множинна індукція, порівняно зі значеннями, отриманими від контрольних тварин.

Стіл в натуральну величину

Вміст колагену в печінці

Аналіз гідроксипроліну проводили, як описано раніше 32, з використанням невеликих фрагментів різних часток, які об'єднували, ліофілізували та гідролізували в 6 N HCl при 110 ° C протягом ночі. Вміст печінкового гідроксипроліну вимірювали спектрофотометрично, використовуючи свіжоприготований реагент Ерліха, і результати виражали як мкг/мг тканини (суха маса).

Статистичний аналіз

Вага печінки, мРНК та аналіз білка (АЛТ, каспаза-3, гідроксипролін) визначали у всіх тварин у повторних експериментах, а значення становили середнє значення ± ± 4 - 9 окремих щурів від кожної групи та часу. Для подвійного ANOVA використовували оцінка. ефект кожного лікування протягом тижнів із використанням пост-тесту Бонферроні. T-критерій Стьюдента використовували для порівняння відмінностей між двома групами. Статистичний аналіз проводили за допомогою PRISM (GraphPad) та значення P * P ** P *** P

Пошкодження печінки та гістопатологія. ( a ) Активність ALAT у сироватці крові зросла до рівня, подібного у щурів, оброблених CCI4 та AAF/CCI4, і значно вищою, ніж у щурів, які отримували AAF. Збільшення активності флуорометричної каспази-3 було подібним у печінці щурів, які отримували або CCI4, або AAF/CCI4, і було значно вищим у тварин, які отримували AAF. ( b ) Співвідношення печінки та маси тіла значно збільшилось у щурів, які отримували AAF/CCI4, після 6 тижнів лікування порівняно з іншими групами. # P * P ** P

Активація розділу LPC. ( a ) Репрезентативне виявлення імунофлуоресценції CK19-позитивних клітин у зрізах печінки виявило накопичення LPC у щурів, які отримували AAF (n = 4) та AAF/CCl4 (n = 9), які з’явилися з портальних ділянок через 4 тижні та розширилися всередині часточок через 6 тижнів (оригінальне збільшення × 200). Вставки демонструють більше збільшення позначення CK19. Такого накопичення LPC не було виявлено в групі CCl4 (n = 9), де мічення CK19 було обмежено клітинами жовчних проток. ( b ) ПЛР у режимі реального часу виявила збільшення експресії мРНК CK19 лише у групах AAF та AAF/CCI4. ( c ) МРНК AFP, виявлена ​​гібридизацією in situ (зонд AFP AS), обмежувалась клітинами протокової відповіді у тварин, які отримували AAF та AAF/CCI4. Спеціального сигналу за допомогою зонда AFP не спостерігалось (початкове збільшення × 400). * позначає портальний тракт. Зображення представляють три незалежні експерименти з трьох різних зрізів печінки щурів.

Повнорозмірне зображення

Фіброз печінки

Повнорозмірне зображення

Вербування та запалення макрофагів. ( a ) Виявлення імунофлюоресценції CD68 (початкове збільшення × 200) виявило позитивні клітини по всій паренхімі печінки у групі AAF, у фіброзній перегородці після обробки CCI4 та у цирозі тварин, які отримували AAF/CCI4. Цифри представляють від 4 (AAF) до 6 (CCI4 або AAF/CCI4) печінкових зрізів. * вказує на портальні тракти. ( b ) Кількісне визначення CD68-позитивних клітин печінки тварин не виявило суттєвої різниці в кількості макрофагів печінки в групах CCl4 та AAF/CCl4 після 4 або 6 тижнів лікування. Дані є середніми значеннями ± семи окремого двопольового аналізу для кожної ділянки печінки від 4 (AAF) до 6 (CCI4 або AAF/CCI4) окремих щурів. Кількісна RT-PCR не показала кількісних відмінностей у експресії ( c ) TNF α або ( d ) МРНК CCR2, що вказує на те, що реакція запалення була подібною у трьох групах.

Повнорозмірне зображення

Під час пошкодження печінки активовані макрофаги виділяють численні цитокіни, включаючи фактор некрозу пухлини α (TNFα), які є мітогенними для гепатоцитів 34, а також LPC. 35, 36 У щурів, які отримували CCI4, ПЛР у режимі реального часу виявила поступову, але обмежену (менш ніж у 4 рази) індукцію мРНК TNFα (рис. 4в) до рівня, який статистично не відрізнявся за показниками AAF та AAF/CCI4. групи. Крім того, мРНК рецептора хемокінів CC мотиву 2 (CCR2), яка експресується лише у рекрутованих моноцитах та деяких Т-клітинах, не відрізнялася у трьох групах (рис. 4г). Низький і подібний ступінь запалення в цих трьох групах на відміну від сильної різниці в подовженні фіброзу, що свідчить про те, що в наших експериментальних умовах запалення не відігравало великої ролі у фіброгенному процесі.

Фіброгенні клітини печінки

HSC або активація портальних фібробластів. ( a ) Імуногістохімічне виявлення SMA-позитивних клітин виявило погано активовані HSC-зв’язуючі портальні судини лише через 6 тижнів введення CCl 4. На відміну від цього, у щурів, оброблених AAF/CCl4, на 2-му тижні було виявлено ряд позитивних клітин навколо воріт, у 4-му тижні в фіброзній перегородці та на 6-му тижні в клітинах перинодулярних клітин. спостерігається при протоковій відповіді. Група ААФ. Зображення представляють від 4 (AAF) до 9 (CCI4 або AAF/CCI4) ділянок печінки при початковому збільшенні × 100. ( b ) Після 6 тижнів обробки CCl 4, більш високе збільшення (× 400) чітко показало SMA-позитивні клітини в центральній фіброзній перегородці, що містять значне відкладення колагену, виявлене червоним фарбуванням пікросіріусом. На відміну від цього, у щурів, оброблених AAF/CCl4, активація HSC або портальних фібробластів була виявлена ​​на початку 2-го тижня навколо LPC, що відбувалося в перипортальних ділянках, злегка пофарбованих червоним мікросирієм. На 6 тижні відзначали маркування та SMA при мостуванні фіброзної перегородки з високим відкладенням колагену.

Повнорозмірне зображення

Виявлення фіброгенних клітин печінки. ( a ) Виявлення імунофлуоресценції та SMA та десмін після 6 тижнів лікування підтверджують активацію HSC на експресуючі міофібробласти та SMA у циротичній печінці щурів, які отримували AAF/CCl4. У фіброзній перегородці лише після введення CCl 4 було зареєстровано дуже мало і SMA-позитивних HSC. Відсутність активованих HSC спостерігалося навколо портальних ділянок в індукованій AAF дукулярній відповіді. Репрезентативні флуоресцентні мікрофотографії двох експериментів на зрізах печінки від двох щурів у кожній групі при початковому збільшенні × 200 ( b ) Кількісний аналіз RT-PCR виявив підвищену індукцію експресії мРНК TGF-β у тварин, які отримували AAF та AAF/CCI4, та ( c ) Виявлення β-мРНК TGF шляхом гібридизації in situ показало сильний позитивний сигнал у LPC у каналоподібних структурах (вставка містить позначку зондового зонда) в обох групах (початкове збільшення × 400). ( d ) Подвійне виявлення імунофлюоресценції білків TGF (зелений) та CK19 (червоний) у зрізах печінки у щурів, оброблених AAF/CCI4, виявило LPC, що експресує TGF β на об’єднаних зображеннях за допомогою конфокального аналізу. Цифри представляють два незалежні експерименти від трьох різних щурів у кожній групі.

Повнорозмірне зображення

EMT LPC

Імунолокалізація мезенхімальних білків до CK19-позитивного LPC у тварин, які отримували AAF/CCI4 після 6 тижнів лікування. a ) Репрезентативні подвійні зображення імунофлуоресценції для CK19 (зелений) та міофібробластичних маркерів (червоний) та SMA, дезмін, FSP1 та колаген 1 у двох експериментах на двох щурах (початкове збільшення × 200). У LPC не можна отримати комбінуючих сигналів між будь-яким мезенхімальним маркером та CK19. ( b ) Конфокальний аналіз підтвердив відсутність мезенхімальних маркерів у CK19-позитивних LPC, які оточені десмин- та SMA-позитивними клітинами (× 630).

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

Цікавим питанням є здатність LPC трансформуватися в міофібробласти за допомогою ЕМТ. 51, 52, 53 Роль ЕМТ у фіброзі була встановлена ​​в легенях та нирках, а в печінці вже повідомлялося про перехід гепатоцитів, жовчних клітин та HSC. 22, 23, 24, 25, 26 TGF β, який, як ми виявили, секретується LPC, є добре відомим індуктором EMT 22, 23, 25, який може викликати перехід LPC автокринним/паракринним шляхом і забезпечити новий потенційний механізм фіброзу . Однак ми не змогли продемонструвати експресію мезенхімальних маркерів (тобто α SMA, дезмін та FSP1) у CK19-позитивних клітинах LPC у щурів, оброблених AAF/CCl 4, in vivo. Перехід ЛПК, організованого в проточних структурах, в ізольовані міофібробласти може бути важко визначити шляхом колокалізації епітеліального та мезенхімального маркерів, особливо якщо втрата епітеліальних характеристик відбувається рано під час процесу ЕМТ. З цих причин доказ LPC, що проходить ЕМТ in vivo, потребує генетичного підходу до карти долі для відстеження долі LPC під час пошкодження печінки. Тим не менше, перехід LPC до міофібробластів після обробки TGF β справді вже був отриманий in vitro, використовуючи LPC, виділений від щурів, які отримували дієту з дефіцитом холіну, доповнену етіоніном. 53

Підводячи підсумок, ми показуємо, що розширення LPC посилює фіброз печінки. Ця сильна фіброгенна реакція, здається, не є прямим наслідком гепатоцелюлярних уражень або запальної реакції, але, схоже, це пов'язано з накопиченням TGF β-продукуючого LPC, що обумовлює міофібробластичну трансформацію фібробластів та/або HSC у пошкодженій печінці. Фіброгенні властивості перипортального ЛПК дають пояснення розвитку переважного перипортального фіброзу, незалежно від того, де знаходиться основне місце ураження печінки, що призводить до порто-центральних фіброзних перегородок, що переростають у цироз.