клітини

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Голодування індукує міграцію гемопоетичних клітин до PVN
  • Характеристика гемопоетичних клітин у ПВН
  • Мікроглія, що експресує BDNF, контактує з нейронами PVN
  • Миші зі специфічною для БМ делецією BDNF гіперфагічні та страждають ожирінням
  • BMT рятує метаболічні відхилення від дефіциту BDNF
  • Обговорення
  • Методи
  • Тварини та дослідження у природніх умовах.
  • Імуногістохімія та імуноелектронна мікроскопія
  • Мікродісекція лазерного захоплення та виділення РНК
  • Кількісна RT-PCR
  • ДНК мікрочипів
  • Зонди гідролізу в RT - PCR для варіантів BDNF
  • Внутрішньоцеребровентрикулярна ін’єкція мононуклеарних клітин
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

  • Кровотворні стовбурові клітини
  • Гіпоталамус
  • Нейротрофні фактори
  • Ожиріння

Резюме

Нейротрофічний фактор, отриманий з мозку (BDNF), пригнічує споживання їжі, впливаючи на нейрони в гіпоталамусі. Тут ми показуємо, що гемопоетичні клітини, що продукують BDNF, контролюють апетит та енергетичний баланс шляхом міграції до паравентрикулярного ядра гіпоталамуса. Ці клітини паравентрикулярного ядра гемопоетичного походження продукують мікрогліальні маркери та встановлюють прямий контакт з нейронами у відповідь на стан живлення. У мишей, вроджених дефіцит BDNF, зокрема в гемопоетичних клітинах, розвивається гіперфагія, ожиріння та резистентність до інсуліну. Ці відхилення зменшуються шляхом трансплантації кісткового мозку клітинами кісткового мозку дикого типу. Крім того, при введенні в третій шлуночок одноядерні клітини кісткового мозку дикого типу містять паравентрикулярне ядро ​​та зворотну гіперфагію у мишей з дефіцитом BDNF. Наші результати пропонують новий механізм контролю годування, заснований на продукуванні BDNF гемопоетичними клітинами, та висвітлюють можливий новий терапевтичний шлях лікування ожиріння.

Вступ

Нейротрофічний фактор, отриманий з мозку (BDNF), який є членом сімейства нейротрофінів, широко експресується в мозку, в тому числі в ключових ядрах гіпоталамусу, які, як відомо, важливі для регулювання енергетичного балансу 1, а також у тканинах периферичних клітин, таких як м'язи, печінка, жирові та гемопоетичні клітини. 2. 3. 4. На додаток до своєї ролі в нейротрофічній дії, BDNF є центральним регулятором енергетичного гомеостазу. Інтрацеребровентрикулярна інфузія BDNF гризунам зменшує раціон і масу тіла 5, 6. На відміну від цього, у мишей, які втрачають одну копію гена Bdnf, розвивається гіперфагія та ожиріння 7, 8. У людини генетична гаплонедостатність BDNF 9, мутації гена, що кодує його рецептор TrkB (NTRK2) 10, та дослідження геномних асоціацій 11, 12 колективно впливають на BDNF у регуляції споживання їжі та розвитку ожиріння.

Щоб визначити походження виробництва BDNF для регулювання енергетичного балансу, попередні дослідження були зосереджені на цілих нейронах мозку або конкретних ядрах в гіпоталамусі 13. Враховуючи нещодавні висновки про те, що гемопоетичні клітини містять тканини мозку і що гемопоетичні клітини рясно експресують BDNF 2, 3, 4, ми дослідили, чи бере участь BDNF, що виробляється гемопоетичними клітинами, що містять тканини мозку, в енергетичному балансі та регуляції апетиту.

Результати

Голодування викликає міграцію гемопоетичних клітин до PVN

Вісім тижнів миші C57BL/6 отримували опромінення всього тіла (9 Гр) та трансплантацію кісткового мозку (BM) (BMT) із зеленого флуоресцентного білка (GFP) 14 трансгенних мишей C57BL/6. Через вісім тижнів ми підрахували кількість клітин, отриманих з ВМ, що експресують GFP, в різних ядрах гіпоталамусу при різних умовах живлення (рис. 1а-с). Ми виявили, що гемопоетичні клітини, одержані від BM, націлені на гіпоталамус, зокрема на паравентрикулярне ядро ​​(PVN), центр насичення їжі та пиття. Цікаво, що голодування (16 або 24 год) призвело до значно більшої кількості клітин GFP + у PVN (рис. 1b); кількість повернулася до вихідного рівня протягом 4 год після повторного годування після 16 год швидкого (рис. 1в). Щільність клітин GFP + істотно не змінилася в інших досліджених ядрах гіпоталамусу (рис. 1г).

40% клітин GFP + виробляють трансформуючий фактор росту β (додаткова фігура S1b), фактор, отриманий з мікроглії, який підтримує виживання нейронів 17 .

Характеристика гемопоетичних клітин у ПВН

Миші із специфічною для БМ делецією BDNF гіперфагічні та страждають ожирінням

Повнорозмірне зображення

( до - c ) Порівняння маси тіла ( до ), споживання їжі ( b ) та споживання води ( c ) у мишей BM-BDNF -/- та Cre (BM-BDNF +/+) (n = 10). Верхній: чоловічий, нижній: жіночий. ( d ) Порівняння рівнів глюкози та інсуліну та відповідних AUC в інтраперитонеальному GTT у BM-BDNF -/- та контрольних мишей Cre (n = 8-11). GTT, тест на толерантність до глюкози; AUC, площа під кривою. ( і ) Споживання O 2 BM-BDNF -/- порівняно з контрольними мишами Cre у світлий та темний період (n = 12). Усі дані представляють середні значення ± sd * P

( а - в ) Вага тіла ( до ), вживання їжі ( b ) і споживання води ( c ) у мишей BM-BDNF -/-, які отримували BMT від мишей BM-BDNF +/+ або BM-BDNF -/- (n = 10) Графіки верхній: самець, нижній: самка. ( d ) Рівні глюкози та інсуліну та відповідна площа під кривою (AUC) через 5 місяців після ВМТ у тих же групах, що і в до (n = 5–6) в GTT. ( і ) Споживання O 2 через 6 місяців після ВМТ в тих самих експериментальних групах, що і в до (n = 9). Зміни в споживанні їжі ( F ) і води ( g ) після інтрацеребровентрикулярної ін’єкції мононуклеарних клітин (n = 4–6). Дані: в середньому 7 днів після ін’єкції клітин. ( h ) Мікроскопічний аналіз GFP-позитивних клітин, що вводяться в PVN. Ліва панель: BM-MNC, виділений з мишей GFP-Tg/BDNF +/+, вводили в третій шлуночок (3 В) мишам BM-BDNF -/-. Права панель: ін'єктували мишей BM-MNC, виділених з мишей GFP-Tg/BDNF -/-. Стрілка: GFP-позитивні клітини. Ваги, 50 мкм. Усі дані представляють середні значення ± sd * P + P = 0,06, + P = 0,08.

Повнорозмірне зображення

Оскільки моноцити та макрофаги присутні в багатьох органах 27, делеція гена BDNF у відповідь на активність Cre, зумовлена ​​промотором LysM, може не обмежуватися мікрогліальними клітинами мозку. Отже, ми порівняли ефекти ін’єкційного введення фізіологічного розчину або BM-MNC, виділеного з мишей GFP-TG/BDNF +/+ або GFP-TG/BM-BDNF -/- у мишах третього шлуночка BM/BDNF - /. Протягом відносно короткого 8-денного періоду внутрішньомозково-судинної ін’єкції, під час якого спостерігалося значне зменшення споживання їжі (рис. 5f) та води (рис. 5g) при GFP-TG/BDNF + рецепторах BMT гемопоетичних клітин, + донор GFP + Клітини, похідні BM, були виявлені в PVN мишей-реципієнтів (рис. 5h).

Обговорення

Багато рядків доказів, представлених у цьому дослідженні, вказують на те, що BDNF, отриманий з гемопоетичних клітин, здається настільки ж важливим, як BDNF, отриманий з нейронів, для контролю апетиту та ожиріння у дорослих тварин. У відповідь на 16-годинний піст гемопоетичні клітини містять ПВН, де вони набувають багато характеристик мікроглії та контактують з місцевими нейронами. Виробляючи специфічний гемопоетичний варіант BDNF, ці клітини, похідні від BM, регулюють споживання їжі за допомогою PVN.

Важливо зазначити, що індуковане голодування клітин, отриманих від BM, на PVN, відбувається як у опромінених мишей, що опромінюють все тіло, у відсутність, так і в присутності захисних головних уборів. Опромінення ЦНС як таке може спричинити пошкодження судинної частини мозку та дозволити аномальному надходженню мікрогліальних попередників з циркуляції до ЦНС 15, 16. Однак ми показали, що в наших експериментальних умовах спостерігалося лише незначне і незначне збільшення (

17%) у кількості клітин, отриманих з ВМ, які мігрували до PVN у мишей без головних уборів у порівнянні з клітинами з головними уборами. Крім того, голодування протягом 16 год викликало порівнянне збільшення кількості гемопоетичних клітин, націлених на PVN, у мишей, захищених головою, порівняно з опроміненими незахищеними мишами.

Характер сигналу, який стимулює міграцію гемопоетичних клітин до PVN, вимагає подальших досліджень. Однак інтригує те, що аналіз мікрочипів показав, що мРНК для Cxcl2, хемокіну, що продукується нейрональними та ендотеліальними клітинами, була у> 30 разів вищою в PVN мишей, що голодували, порівняно з мишами, що годувались (Додаткова таблиця S2). Хемокіни та цитокіни беруть участь у пошуку мікроглії або клітин, похідних БМ, у нервовій системі, особливо у відповідь на травму чи ішемію головного мозку 17 або травму спинного мозку 29. Cxcl2 виявляє потужну хемотаксичну активність щодо торгівлі КМ/гемопоетичними клітинами. Її висхідна експресія в PVN у цих тварин може бути пусковим механізмом для міграції клітин, отриманих з BM, до PVN протягом 16-годинного голодування.

Це початковий звіт про націленість голодування гемопоетичних клітин на PVN, ядро ​​гіпоталамусу, де BDNF, що виробляється цими клітинами, може негативно регулювати апетит. Потужність BDNF, що походить від BM, щодо апетиту in vivo виявляється у мишей BM-BDNF -/-, нездатність яких реагувати на голодування через надмірне утворення BDNF у їх PVN проявляється як полідипсія, гіперфагія та ожиріння. Інші лабораторії повідомляють, що голодування викликає зменшення

Методи

Дослідження на тваринах та in vivo.

Імуногістохімія та імуноелектронна мікроскопія

Мікродісекція лазерного захоплення та виділення РНК

Зразки тканин із заморожених зрізів товщиною 12 мкм для аналізу РНК отримували з кожного ядра гіпоталамуса або 50 захоплених GFP-позитивних або -негативних клітин на одну кришку CapSure HS LCM (Arcturus Engineering, Mountain View, CA) з використанням таких параметрів: розмір плями = 7,5 мкм; потужність = 50–80 мВт; а тривалість імпульсу = 50–1000 мкс. Загальні РНК виділяли набором для виділення РНК PicoPure (Arcturs) та обробляли ДНКазою I (Invitrogen).

Кількісна RT-PCR

Ми провели кількісну RT - PCR із LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit та LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics). Випромінювану флуоресценцію для кожної реакції вимірювали три рази протягом фази відпалу/розширення, а графіки ампліфікації аналізували за допомогою системи LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Потенційне забруднення геномної ДНК контролювали за допомогою деяких праймерів, що охоплюють інтрон, та розщеплення ДНКази. Відносне значення в кожній пробі обчислювали за стандартною кривою, отриманою з контрольних зразків, і стандартизували як коефіцієнт, поділений на значення, одночасно отримане для гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) у тому ж експерименті. КДНК першої ланцюга використовували для подальших аналізів ПЛР. Були використані наступні праймери: BDNF; 5 ′ праймер, 5′-TTGTTTTGTGCCGTTTACCA-3 ′ і 3 ′ ґрунтовка нижче за течією, 5′-GGTAAGAGAGCCAGCCACTG-3 ′, GAPDH; 5 ′ ґрунтовка вище за течією, 5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3 ′ і 3 ′ ґрунтовка нижче за течією, 5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3 ′. Ідентичність продуктів ПЛР підтверджена розміром після електрофорезу в агарозному гелі та аналізу послідовності нуклеотидів. Сигнал, що виникає від мРНК GAPDH, служив внутрішнім контролем для оцінки відмінностей між різними зразками.

ДНК мікрочипів

Ми захопили GFP-позитивні клітини від п’яти різних мишей GFP-BMT або цілі PVN від п’яти мишей дикого типу як під час годування, так і під час голодування (16 год) за допомогою LCM. Зразки були надіслані до дослідницької лабораторії Bio Matrix (Японія), де зразки РНК перевіряли Agilent 2100 BioAnalyser (Agilent Technologies) та NanoDrop (NanoDrop Technologies). Зразки РНК ампліфікували за допомогою двоциклового мічення мішені, перетворювали на біотинільовану кДНК і гібридизували з масивом геноципів Affymetrix Mouse Genome U34A (Санта-Клара, Каліфорнія). Ми використовували Gene Spring Viewer (Agilent Technologies) для аналізу даних та обчислювали коефіцієнт експресії (r = натще/годування). Ми показали експресію генів, пов'язаних з мікроглією (LCM GFP-позитивних клітин), та цитокінів та генів, пов'язаних із запаленням (LCM цілого PVN), з результатами r> 2 та r 21 (Додаткова таблиця S4). Ампліфікацію проводили за допомогою ПЛР-аналізів у реальному часі, використовуючи зонди 5′FAM (Sigma Genosys) на LIGHT CYCLER 480 System II (Діагностика Roche). Кінцевий реакційний об’єм 20 мкл включав 5 мкл кДНК, 0,5 мкМ кожного праймера (прямий праймер та зворотний праймер), 0,1 мкМ зонда 5′FAM та 10 мкл LightCycler 480 Probes Master (Roche Diagnostics).

Внутрішньоцеребровентрикулярна ін’єкція мононуклеарних клітин

Ми виділили мононуклеарну фракцію клітини з миші BM за допомогою Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). Після анестезії голова мишей була закріплена за допомогою стереотаксичних інструментів (SR-6, Scientific Instrument Lab., Токіо, Японія). Клітини вводили в третій шлуночок за допомогою голки 30 Г, прикріпленої до шприца Гамільтона, згідно з координатами, отриманими з підручника Paxinos і Watson 34 (-0,82 мм від брегми). Введений об’єм суспензії клітин становив 5 мкл, а кількість клітин на мишу - 1 × 10 6 .

статистичний аналіз

Результати представлені як середні значення ± sd Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS Statistics 19. T-критерій Стьюдента використовували для порівняння двох незалежних груп, а односторонній дисперсійний аналіз або повторний дисперсійний аналіз дисперсії з подальшим тестом багаторазового порівняння використовували для порівняння трьох або більше груп. Статистично значущу різницю визначали як величину Р