предметів

реферат

Фактор обміну нуклеотидів Trio Rho Guanine (RhoGEF) Тріо сприяє полімеризації актину шляхом безпосередньої активації невеликої GTPase Rac1. Недавні дослідження показують, що поведінкові фенотипи, пов'язані з розладами аутистичного спектра (АСД) на тваринних моделях АСД, можуть бути спричинені порушенням регулювання Rac1 контролю полімеризації актину в глутаматергічних синапсах. У людини ми виявили велику групу мутацій, пов’язаних з de novo ASD, у домені активації Trio Rac1, GEF1. Наше дослідження показує, що ці мутації продукують гіпофункціональну або гіперфункціональну форми Тріо у нейронах гризунів in vitro. Відповідно до патологічного збільшення або зменшення глутаматергічної нейромедіації, що спостерігається на тваринних моделях АСД, ми виявляємо, що ці мутації призводять або до зменшення експресії синаптичних рецепторів AMPA, або до посилення глутаматергічного синаптогенезу. У сукупності наші висновки свідчать як про надмірну, так і про знижену активність Тріо, а також про наслідки синаптичної дисфункції в патогенезі, пов’язаному з АСД, і вказують на шлях Тріо-Rac1 в глутаматергічних синапсах як на можливу ключову точку зближення багатьох генів, пов’язаних з АСД.

Нещодавно ми виявили, що білок Trio гуанінового обмінного фактора (RhoGEF), разом із його паралогом Калірін, необхідний для глутаматергічної нейромедіації 9. Експресія тріо в головному мозку найвища у пізньому пренатальному/ранньому постнатальному розвитку, тоді як експресія Калірину досягає максимуму до підліткового віку 10, 11, 12. Кілька ізоформ Тріо, отримані з одного гена, експресуються в мозку 13. Наприклад, Тріо-9 є переважною ізоформою, що експресується в корі та гіпокампі. І тріо, і Калірін знаходяться в постсинаптичному відділі глутаматергічних синапсів, іменованих дендритними спінами 10, 14. У спінах ці два білки регулюють функцію глутаматергічного синапсу завдяки здатності їх доменів GEF1 сприяти полімеризації актину, залежній від Rac1, 9, 15, 16. Крім того, ми виявили, що Тріо і Калірин є мішенями фосфорилювання CaMKII, які необхідні для індукції довготривалого потенціювання (LTP) 9, клітинного процесу, який, як вважають, є основою для навчання та пам'яті. Таким чином, ці білки відіграють вирішальну роль у регуляції глутаматергічного синапсу.

Тут ми ідентифікуємо велику групу мутацій, пов’язаних з de novo ASD, у домені активації Rac1 Тріо, GEF1. Ступінь мутаційної кластеризації, виявленої в домені Trio GEF1, та обчислюваний прогнозований ефект цих мутацій, пов'язаних з новим ASD, на взаємодії Trio-Rac1 свідчать про сильну асоціацію порушення регуляції шляху Trio-Rac1 при патологіях, пов'язаних з ASD. Систематичне дослідження цих мутацій у Тріо-9 виявляє як гіпоморфні, так і гіперморфні мутації, які різко та двоспрямовано впливають на функцію Тріо та вплив Тріо на глутаматергічну нейромедіацію пірамідних нейронів СА1 гіпокампа. Моделі ASD на тваринах демонструють патологічне збільшення та зменшення глутаматергічної нейромедіації 17, 18, 19. Наше дослідження виявило мутації міссенсу, пов'язані з ASD, в одному синаптичному Rac1-активуючому білку, який може спричинити двонаправлені зміни в глутаматергічній нейромедіації, таким чином маючи на увазі як знижену, так і надмірну активність Тріо та наслідки синаптичної дисфункції при захворюваннях, пов'язаних з ASD.

результат

Мутації, пов'язані з ASD в Тріо

мутації

Мутації De novo, пов'язані з РАС у Тріо. Мутації промаху, b нісенітниця а c номер копії в Тріо у осіб з розладами, пов'язаними з РАС. Повідомляються про різні домени білка, починаючи з N-кінця: домен Sec14, повтори спектру, домен GEF1 (складається з домену гомології Dbl (DH1) та домену гомології плекстрину (PH1)), домену гомології 3c Src (SH3) та домену GEF2 ( складається з домену гомології Dbl (DH2) та домену гомології Плекстрина (PH2)). Для кожної мутації надається індивідуальний діагноз, а також інформація про зміну послідовності амінокислот Trio. Розташування амінокислотних мутацій з NP_009049.2

Повнорозмірне зображення

Згідно з недавнім аналізом консорціуму з агрегації Exome (ExAC), заснованого на 60 706 повністю секвенсованих геномах людини, TRIO є одним із 60 найбільш обмежених генів людини, що свідчить про високе функціональне значення. Тріо має винятково низьку кількість мутацій міссенсу (z = 6, 29) та втрату функції (LoF) безглуздих мутацій (pLi = 1), маючи середній рівень синонімічних мутацій (z = 0, 19) 27 . Обмеження в домені GEF1/DH1 є ще більш вираженим. Примітно, що ми не виявили жодних помилкових або втратних функціональних мутацій (LoF) у домені GEF1/DH1 у 9 937 контрольних геномах 24 (таблиця 1 та рис. 2а), що свідчить про сильне збагачення мутацій, пов'язаних з ASD у цій області (рис. 1). 2б). Ми також не виявили відсутність мутацій у домені GEF1/DH1 у базі даних 1000 Genomes 28 (додатковий малюнок 1a). Що важливо, синонімічні мутації, перелічені в базі даних 1000 геномів, були присутніми в цьому регіоні (додатковий малюнок 1b). У сукупності ці дані вказують на сильне збагачення мутацій, пов’язаних з новим ASD, в області тріо GEF1/DH1.

Стіл в натуральну величину

Тріо мутацій, виявлених у контрольних та пов'язаних з ASD геномах. Мутації тріо-9, виявлені в контрольних геномах (De Rubeis et al., 2014 24). b Графік показує кількість мутацій, пов’язаних з ASD (червоні смуги) та контрольних елементів (чорні смуги), знайдених у кожному домені Trio-9 у осіб з порушеннями, пов’язаними з ASD, та контрольних груп без порушень, пов’язаних з ASD. Збагачення мутації Trio, пов’язаної з ASD, у кожному домені Trio обчислювали шляхом віднімання кількості контрольних мутацій з числа мутацій, пов’язаних з ASD, які спостерігаються у кожному домені. Прозорі трикутники представляють наявність (червоний), відсутність (чорний) та величину збагачення ASD, пов’язаного з мутацією, у кожному домені.

Повнорозмірне зображення

Для оцінки значущості мутацій білка Trio та доменів Trio-GEF1/DH1 при розладах, пов’язаних з ASD, ми порівняли очікувану кількість мутацій de novo із спостережуваними мутаціями. Ми використовували мутаційну модель, розроблену Samocha et al. 29. Результати Samocha et al. Вони базувались на 1078 випадках РАС та 151 випадку психічних вад, і це дослідження змогло визначити SCN2A та SYNGAP як важливі при розладах, пов’язаних з АСД. У цьому дослідженні ми спостерігали набагато більшу кількість випадків (4890 при розладах, пов'язаних з РАС), і велику кількість відсутніх мутацій при ТРІО (11 випадків РАС порівняно з 1,07 випадками, очікуваними для такої ж кількості осіб у загальній популяції) . суттєво покращила статистику, що призвело до надзвичайно значущої асоціації TRIO із цілим синдромом із ASD-подібними синдромами (значення Р -8; Додаткова таблиця 3). Ми виявили ще сильнішу зв'язок із синдромами, пов'язаними з ASD, для субдомену RF1/DH1, що взаємодіє з Rac1 (7 випадків порівняно з очікуваним 0, 06, значенням Р 13; Додаткова таблиця 3).

Вважається, що мутації ASD у Тріо змінюють активацію Rac1

Прогнозовані ефекти мутацій DH1, пов'язаних з ASD, на активацію Rac1. Домен GEF1 у контексті всього білка показаний вище, домен GEF1 позначений пунктирним червоним квадратом. Огляд структури комплексу Trio-GEF1 та Rac1 наведено нижче, причому два взаємодіючі білки показані як сині та помаранчеві карикатури (білковий код 2NZ8). Залишки амінокислот, мутовані при захворюваннях, пов’язаних з ASD, показані у вигляді гранул з пурпуровими атомами вуглецю. Змішані вставки представляють взаємодію між амінокислотними залишками дикого типу та мутантним білком. Залишки дикого типу позначені і представлені у вигляді палички, атоми вуглецю пофарбовані у фіолетовий колір. Мутовані амінокислоти показані із зеленими або жовтими атомами вуглецю. Водневі зв’язки/сольові містки показані штриховими лініями. Молекули води, які беруть участь у взаємодіях GEF1-Rac1, позначаються прозорими червоними кульками

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Експресія Trio-9 I1329HLAL * пригнічує синаптичну функцію

Повнорозмірне зображення

Зменшення амплітуди AMPAR-eEPSC на 40% (рис. 4h, j). Експресія Trio-9 I1329HLAL * не впливала на амплітуду NMDAR-eEPSC (рис. 4i, k). Цей фенотип був надзвичайно схожий на фенотип, який спостерігався при TrO shRNA. Ефективність парного імпульсу (PPF) також не змінилася завдяки постсинаптичній експресії Trio-9 I1329HLAL *, що вказує на те, що експресія цього мутанта не впливала на вивільнення пресинаптичного глутамату (рис. 41).

Експресія Trio-9 K1431M пригнічує синаптичну функцію

Потім ми дослідили мутацію Trio missense, Trio-9 K1431M. Особа з такою мутацією виявила важкі аутичні симптоми та розумову відсталість. Слід зазначити, що попереднє дослідження з використанням мутацій при скануванні аланіну для виявлення важливих залишків у регіоні GEF1 Trio виявило цей залишок разом з R1428 як критичний для активації Rac1. Наше моделювання мутації K1431M передбачало порушення низки взаємодій, що опосередковуються воднем та водою, що призвело до зниження спорідненості між доменами Trio GEF1/DH1 та Rac1 (рис. 3 та таблиця 2). Аналіз FLIM показав, що Trio-9 K1431M, як і Trio-9 I1329HLAL *, значно знижує здатність Trio-9 активувати біосенсор Rac1 в клітинах HEK293 (рис. 5b). Як і передбачалося, ця мутація була сильно зменшена завдяки активації Rac1. Потім ми експресували Trio-9 K1431M у пірамідних нейронах CA1 і виявили, що Trio-9 K1431M фенокопічний Trio-9 I1329HLAL *. Тріо-9 К1431М викликано

Зменшення амплітуди AMPAR-eEPSC на 50% (рис. 5в), що також, ймовірно, зумовлене збільшенням тихих синапсів, оскільки відбулося зменшення квантового вмісту без зміни амплітуди NMDAR-eEPSC або зміни PPF (рис. 5d-f). Подібно до Trio-9 дикого типу, зміна амплітуд NMDAR-eEPSC у нейронах, що експресують Trio-9 K1431M, було обумовлено коливаннями квантового вмісту (додаткове зображення 4c). У сукупності ці дані вказують на те, що Trio-9 K1431M, як і Trio-9 I1329HLAL *, швидше за все, буде конкурувати з ендогенним Trio дикого типу в синапсах і призведе до зменшення синаптичної функції AMPAR. Крім того, ми виявили, що мутація помилки в домені Trio GEF1, яка була виявлена ​​у особи без ASD (Trio-9 S1575N) 28, не впливала на здатність Trio-9 збільшувати амплітуду AMPAR-eEPSC у піраміді CA1. нейрони (додаткова фігура 1а). a 5).

Повнорозмірне зображення

Експресія Trio-9 P1461T пригнічує синаптичну функцію

Повнорозмірне зображення

Trio-9 D1368V призводить до гіперфункції Trio

Конкретна асоціація мутацій Trio з ASD підтверджується аналізом його близького паралогу, Каліріну, який має унікальний профіль розвитку експресії. Жодних мутацій місенсу, пов'язаних з РАС, у Каліріну не спостерігалося, хоча вони відігравали подібну роль у регуляції глутаматергічного синапсу 9. Тріо сильно виражається в ранньому постнатальному розвитку і зменшується з віком 10 років. На відміну від цього, експресія калірину не досягає піку до підліткового віку 11, 12. Примітно, що функція калірину пов'язана з пізніше нервово-психічними розладами, такими як шизофренія та хвороба Альцгеймера 38, 39, 40, 41. Мутація в домені GEF1/DH1 калірину, яка інгібувала активацію Rac1, також була виявлена ​​у людини з шизофренією. Таким чином, профілі експресії Тріо та Калірину, як видається, відповідають віку початку захворювань, якими вони беруть участь, що свідчить про те, що опосередкований Rac1 порушення синаптичної регуляції в різні моменти часу в розвитку мозку призводить до різних захворювань, пов'язаних з мозком .,

Нещодавно було виявлено, що порушення синаптичної регуляції актину, опосередкованої Rac1, лежать в основі розвитку поведінкових фенотипів, пов'язаних з ASD, у добре встановлених моделях тварин, пов'язаних з ASD, захворюваннями 5, 6, 7. Недавнє дослідження також визначило Rac1 як вірогідну точку зближення низки генів ризику ASD 8. Тут ми ідентифікуємо домен активації Rac1 регуляторного білка синаптичного актину, Trio, як гарячу точку для мутацій de novo, пов’язаних з ASD. Оскільки, як вважають, порушення регуляції глутаматергічної нейромедіації лежить в основі поведінкових фенотипів у багатьох тваринних моделях АСД, а також тому, що не виявлено, що білки нижче активності Тріо містять значні мутації, пов’язані з АСД, спокусливо припустити, що змінена функція Тріо є головним моментом. збіжності ряду факторів, що породжують РАС. Надалі буде необхідно визначити поширеність зміненої функції Тріо у осіб з РАС та встановити, чи можна застосовувати терапію, пов’язану з Тріо, для зворотних поведінкових фенотипів, пов’язаних з АСД, у значної кількості осіб з цим захворюванням.

методи

Мутаційне моделювання

Вплив мутацій на стабільність та зв'язування прогнозували за допомогою кристалічної структури з високою роздільною здатністю комплексу Trio GEF1 з Rac1 (код PDB 2NZ8). Розрахунки проводились із застосуванням програмного забезпечення для молекулярного моделювання ICM (ТОВ «Молсофт»). Енергетичну оптимізацію мутантної конформації білка проводили за допомогою зміщеного ймовірного алгоритму Монте-Карло. Потім зміна вільної енергії у стабільності білка ∆∆ стабільності G (1) та зв’язуванні з білком ∆∆ зв’язку G (2) розраховували як різницю у згортанні або зв’язуванні вільних енергій мутантного та білка дикого типу:

Мутації з зв'язком ∆∆G> 2 або стабільністю ∆∆G прогнозували як руйнівні для активації Тріо Rac1.

Експериментальні конструкції

Людське Тріо-9 (або Тріо-9 у посиланні 13) було отримано з кДНК Trio-FL, щедро наданої Dr. Бетті А. Ейпер (Університет штату Коннектикут). Мутації Trio, пов'язані з ASD, були зроблені з кДНК Trio-9 з використанням ПЛР із перекриттям з розширенням, з подальшим клонуванням In-fusion (Clontech). Всі плазміди підтверджували секвенуванням ДНК. КДНК тріо-9 клонували у вектор pCAGGs, що містить IRES-mCherry. Вектор pFUGW, що експресує лише GFP, ко-експресували з конструкціями pCAGG-IRES-mCherry для посилення ідентифікації трансфікованих нейронів і використовували як контрольний вектор для візуалізації хребта. Конструкція біосенсора Rac1 знаходилась у структурі pTriEx-HisMyc, як було описано раніше у посиланні 30 і був щедро наданий доктором Яап Д. ван Буул (Sanquin).

Трансфекція клітин HEK293

Клітини HEK293T (ATCC) культивували в DMEM з 10% FBS в інкубаторі 37 ° C, забезпеченому 5% CO 2. Клітини наносили на 35-міліметрові скляні денні пластини, покриті Матрігелем. Клітини вирощували до злиття 50% перед трансфекцією експресійними конструкціями Trio-9 разом з біосенсором Rac1 з використанням реагенту для трансфекції FuGENE HD. Використовували співвідношення біосенсорної ДНК Trio-9/Rac1 1: 1. Покриті клітини інкубували в трансфекційній суміші протягом 16 год, а потім замінювали свіжими середовищами. Були проведені експерименти HEK293

20 год після трансфекції.

Флуоресцентне зображення протягом усього життя (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

Фазор біосенсора FRET за відсутності активатора був отриманий із незалежного препарату. Фазор, що відповідає загартованому донору, розраховували відповідно до рівняння загартування (3). Позиції всіх можливих фазорів, які гасяться з різною ефективністю, описують криву траєкторію на фазовому графіку. Експериментальне положення фазора даного пікселя вздовж траєкторії визначало величину загартування і, отже, ефективність FRET. Вклади фону та донора без акцептора оцінюються з використанням правила лінійної комбінації 49, 52, при цьому фоновий фазор та донор не згасають визначаються незалежно. Всі фазові перетворення та аналіз даних FLIM-даних проводили за допомогою програмного забезпечення SimFCS (Каліфорнійський університет, Ірвін).

електрофізіологія

Аналіз щільності хребта

Для аналізу щільності хребта, контролю та експериментальних пірамідних нейронів CA1 в органотипових культурах зрізових культур гіпокампа, виготовлених із щенят щурів Р6, біолістично трансфікували конструкціями FUGW-GFP та pCAGGS-IRES-mCherry приблизно через 18–20 год після посіву. Зображення отримували на DIV 7 за допомогою мікроскопії з надвисокою роздільною здатністю (Elyra Microscope System, Zeiss). Для використання з наявним перевернутим мікроскопом та лінзою, що заглиблює олію, зрізи фіксували у 4% PFA/4% сахарози у PBS і промивали 3 × PBS. Для посилення сигналу GFP зрізи потім блокували і пронизували 3% BSA в PBS, що містить 0,1% Triton-X, і фарбували первинним антитілом проти GFP (2 мкг/мл, Life Technologies A-11122) з подальшим промиванням у PBSTx та фарбуванням з кон'югованим Alexa 488 вторинним (4 мкг/мл, Life Technologies A-11034). Зрізи далі обробляли скороченим протоколом 55 на базі SeeDB, намагаючись зменшити сферичну аберацію. Потім зрізи монтували в SlowFade Gold (Life Technologies) для візуалізації. Z-стоси виготовляли із зрізів 30 мкм вторинних верхівкових дендритів

30 фр. Від соми. Зображення були отримані з масляним об'єктивом 100 × (100 ×/1,46) в режимі SIM з використанням поставленої SIM-сітки 42 мкм, обробленої та реконструйованої з використанням програмного забезпечення (Zen, Zeiss). Експериментатор, засліплений умовою зображення, виконував аналіз зображення на окремих ділянках за допомогою ImageJ для підрахунку шипів, що відходять убік від дендриту.

Статистичний аналіз

Для статистики мутацій, пов’язаної з ASD у Тріо, ми використовували простий тест Пуассона, подібний до того, що застосовувався у Samocha et al. 29. Очікувана кількість мутацій de novo у білку Trio у 4890 осіб з розладами, пов’язаними з ASD, була розрахована на основі імовірності генно-специфічних мутацій, визначеної Samocha et al. Очікувана кількість мутацій de novo в домені Trio-GEF1/DH1 була оцінена шляхом масштабування очікуваної кількості мутацій у Trio з припущенням рівної ймовірності мутації вздовж гена. Використовували поріг значущості P-значення для геному −6. Для парних електрофізіологічних записів амплітуди eEPSC використовували тест підписаного рангу Вілкоксона для парних даних. Підсумовані тести рангу Вількоксона використовувались для порівняння електрофізіологічних даних у незалежних умовах. Вимірювання парного полегшення пульсу та дані щільності хребта аналізували за допомогою парного та непарного t-тесту Стьюдента відповідно. Всі проведені статистичні тести були двосторонніми та з усіма тестами Р-значенням