Предмети

Резюме

Вступ

Ожиріння - це надмірне накопичення жиру в організмі, що є важливою складовою метаболічного синдрому, сузір’ям гіпертонії, діабету, дисліпідемії та жирової хвороби печінки, що збільшує ризик серцево-судинних захворювань 11. Хоча загальновизнано, що SFA як група сприяє абдомінальному ожирінню, дисліпідемії, резистентності до інсуліну, порушенню толерантності до глюкози та системним запаленням12, ця роль SFA у ожирінні, діабеті та серцево-судинних захворюваннях ставиться під сумнів. Недавні дослідження показують, що реакції, викликані SFA, залежать від довжини ланцюга, з чіткими різницями в біологічних реакціях між лауриновою кислотою та пальмітиновою кислотою 13. Однак ролі SFA в індивідуальному харчуванні при OA не були чітко визначені.

Наші попередні дослідження повідомляли, що протягом 16 тижнів у молодих самців щурів Вістар дієта з високим вмістом вуглеводів і жирів (Н, що містить переважно фруктозу та яловичий жир) імітує симптоми метаболічного синдрому людини, включаючи абдомінальне ожиріння, збільшення загального жиру в організмі, підвищений вміст ліпідів у крові та артеріального тиску, порушення толерантності до глюкози та чутливості до інсуліну, реконструкція жиру у печінці та серцево-судинній системі 14. У цьому дослідженні досліджена роль SFA від C12 до C18 (лауринова кислота (LA; C12: 0), міристинова кислота (MA; C14: 0), пальмітинова кислота (PA; C16: 0) та стеаринова кислота (SA; C18: 0), а також яловичий жир (переважно трансжирні кислоти та трансжирні кислоти) як за ознаками метаболічного синдрому, так і при розвитку ОА.

Результати

SFA при метаболічному синдромі

Щури, які отримували дієту з високим вмістом вуглеводів, а також яловичий жир, що містить як насичені жири, так і трансжир (дієта H), розвинули зміни, пов'язані з метаболічним синдромом людини, включаючи абдомінальне ожиріння, гіперлептінемію, гіперліпемію та порушення функції печінки порівняно з кукурудзяною дієтою (дієта С). (Таблиця 1), однак, у щурів Н не виявляли гіперглікемії та гіперінсулінемії у порівнянні з щурами С. Дієта С має низьку щільність енергії, і, можливо, з цієї причини споживання їжі було більшим у щурів С, ніж у всіх інших групах. Хоча споживання їжі було вищим у щурів С, споживання енергії було вищим у всіх групах дієти з високим вмістом жиру, ніж у щурів С в порядку С

кислоти

( ДО ) Тривимірне зображення повних колінних суглобів щурів та реконструйованих осьових мікро-КТ (вставка) зображень поперечного перерізу області, що представляє інтерес, тобто медіального та латерального великогомілкового плато, що показує змінену архітектуру субхондральної кістки (жовті стрілки показують аномальну кістку) морфологічні зміни . Для морфометричного аналізу ( B ) Частка об’єму кістки (BV/TV) була розрахована як відношення сегментованого об’єму кістки (BV) до загального об’єму (TV) регіону, що цікавить. Що ще, ( C. ), також розраховували мінеральну щільність кісткової тканини (МЩКТ) в регіоні, що нас цікавить. Всі значення представлені як середнє значення ± SD (P 2 (Avg.OS.L), збільшене у щурів H, HPA та HSA порівняно з щурами C, що свідчить про збільшення ремоделювання кісток та порушення регульованого мінерального обміну, спричиненого дієтами The Avg. Щільність OS.L щурів HLA та HMA була дуже схожою на щільність щурів C. Зниження присутності середнього ядра остеоцитів (Середнє значення OS.N) у щурів H, HMA, HPA та HSA у порівнянні з щурами С дієти викликають апоптотичну загибель остеоцитів (Додаткова таблиця 2).

SFA в хондроцитах людини та експлантатах хряща великої рогатої худоби

( ДО ) ACAN, ( B ) COL10A, ( C. ) MMP13, ( D ) ADAMTS4, ( І ) ADAMTS5 та ( F ) Рівні мРНК RUNX2 оцінювали за допомогою RT-PCR як у пацієнтів без IL-1β, так і в гранулах IL-1β. Усі експериментальні зразки проводили у трьох примірниках. Всі значення представлені як середнє значення ± SD (P

Обмеження цього дослідження включають те, що ми не вимірювали синовіальні морфологічні зміни або зміни концентрації цитокінів у синовіальній рідині. Ці два додаткові параметри можуть сприяти додатковій інформації для розуміння місцевих змін внаслідок запалення в дієтах АГС і, отже, покращити розуміння ОА, спричиненої ожирінням.

На закінчення, це дослідження пропонує докази того, що SFA може спричинити подібні зміни як в метаболічному синдромі, так і в ОА. Ці зміни корелюють із концентрацією лептину та інсуліну в плазмі крові, які беруть участь у ожирінні, цукровому діабеті 2 типу та ОА. Наші дані дозволяють припустити, що заміна традиційних дієт, що містять кокосове горіхове масло, на PA, отримане з пальмової олії, або SA, отримане з тваринного жиру, може погіршити розвиток метаболічного синдрому та OA. Крім того, необхідні клінічні випробування на людях, щоб визначити, чи заміна ПА та СА в дієті на ЛА пом'якшить або поверне розвиток ОА та метаболічного синдрому, особливо ожиріння та гіпертонії.

Методи

Дизайн дослідження та дієти.

Вимірювання метаболічних змінних.

Щоденне вимірювання маси тіла та споживання їжі та води проводили для моніторингу щоденного здоров'я щурів. Ефективність перетворення корму (%) розраховували, як описано раніше [14]. Відсоток приросту маси тіла за 16 тижнів обчислювали як різницю у масі тіла між днем ​​0 і днем ​​112. Окружність живота вимірювали кожні 4 тижні за допомогою стандартної мірної стрічки під легкою анестезією Золетилом (пілетаміну 10 мг/кг, золазепаму 10 мг/кг в/в); Вірбак, Пікхерст, Новий Південний Уельс, Австралія).

Щурів евтаназували через 16 тижнів за допомогою Lethabarb® (100 мг/кг пентобарбітону натрію, в/в). Після евтаназії збирали кров для виділення плазми, а плазму зберігали при -20 ° C перед подальшим аналізом. Серця виділяли для підготовки серця Лангендорфа до вимірювання постійної діастолічної жорсткості. Після цього такі тканини, як печінка, лівий шлуночок (із перегородкою), правий шлуночок та черевні жирові прокладки (включаючи заочеревинну, придаткову оболонку та сальникову тканину), видаляли для зважування та виражали у мг/мм довжини великої гомілки. Плазмові концентрації лептину, інсуліну, загального холестерину, тригліцеридів та нестерифікованих жирних кислот (NEFA) вимірювали, як описано раніше [14] .

Оцінка суглобового хряща.

Аналіз апоптозу TUNEL

Кінцева дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) dUTP Nick-End Marking (TUNEL) була використана для ідентифікації клітин, які демонструють деградацію їх ДНК під час апоптозу. Зрізи тканин спочатку просочували протеїназою К протягом 30 хвилин при 37 ° С. Слайди промивали PBS і аналіз проводили за протоколом виробника (Roche, Німеччина). Зрізи інкубували з DNase1 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі як позитивний контроль. Для аналізу напівкількісних даних позитивні клітини з різних полів спостереження підраховували і нормували до кількості клітин на 100 загальних клітин у кожній групі, використовуючи ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 39 .

Оцінка змін субхондральної кістки.

Мікро-КТ проводили для аналізу субхондральних змін кісток. Стегнову кістку та гомілку сканували за допомогою мікро-КТ (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Швейцарія) з ізотропним розміром вокселя 18 мкм при напрузі 55 кВ та струмі 145 мкА з алюмінієвим фільтром 0,5 мм. . Час експозиції становив 1180 мс, а вбудоване програмне забезпечення Scanco використовувалося для сегментації набору даних 39. Ручні області, що представляють інтерес (ROI), були намальовані навколо анатомічного контуру в області субхондральної кістки на медіальному та латеральному великогомілковому плато. Обсяг відсотків (VOI) складався зі стеку рентабельності інвестицій (25 розділів). VOI починався нижче субхондральної пластинки, простягаючись дистально у напрямку до пластини росту. Розраховували взаємозв'язок між об'ємом кістки та загальним обсягом (BV/TV) та мінеральною щільністю кісткової тканини (BMD) з VOI.

Аналіз на остеоцити.

Середнє значення порожніх лакун остеоцитів (Avg OS.L) і середнього ядра остеоцитів (Avg OS.N) підраховували на одиницю площі (мм 2) в області субхондральної кістки на медіальному великогомілковому плато за допомогою ImageJ (NIH, Бетесда, доктор медичних наук).

Лікування хондроцитів та експлантатів хряща SFA

Підготовка SFA

LA, MA, PA та SA були придбані комерційно з найвищою доступною чистотою (Sigma-Aldrich, GC очищений, хімічно синтезований). В якості носія було обрано бичачий сироватковий альбумін (BSA) (без жирних кислот, Sigma Aldrich). Складні розчини SFA-BSA проводили із застосуванням описаного раніше протоколу [6]. Окремі SFA розчиняли у 100% етанолі при 70 ° C з отриманням 200 мМ вихідного розчину. Потім основний розчин розбавляли 1:10 у 10% (мас./Об.) BSA, виготовленому з модифікованим середовищем Орла (DMEM) Дульбекко, протягом 10 хвилин при 55 ° C. Отриманий розчин SFA (20 мМ) фільтрували стерильно (0,45 мкМ фільтр ) перед нанесенням на культури клітин за допомогою описаного раніше протоколу [6]. Контроль транспортного засобу (негативний контроль) був BSA без жирних кислот з тією ж концентрацією етанолу.

Культура хондроцитів та експлантати великої рогатої худоби.

Хондроцити збирали за допомогою ферментативного травлення та культивували, використовуючи наші опубліковані протоколи 39. Коротко, біопсії суглобового хряща були отримані у первинних хворих на ОА, які перенесли операцію з заміщення коліна в лікарні Принца Чарльза (Брісбен, QLD, Австралія). Усі біоптати хряща були взяті з частини поверхні виростка стегнової кістки, яку хірург вважав схожою на цілий та здоровий хрящ. П’ятьма донорами були чоловіки у віці 60–65 років, і всі вони надали письмову інформовану згоду. Дослідження було схвалено Госпіталем принца Чарльза та Комітетами з людської етики Квінслендського технологічного університету. Кожен зразок хряща був далі охарактеризований та оцінений за шкалою Манкіна, для подальших експериментів використовувались лише зразки з оцінками 0–1 (здоровий хрящ).

Хрящ розсікали з кістки і розщеплювали розчином колагенази 2 (Invitrogen, Lakewood, NJ) протягом ночі в культуральному середовищі DMEM для виділення хондроцитів суглобового хряща (ACC). Після перетравлення АСС (2,5 × 10 5 клітин) гранулювали центрифугуванням у 15 мл пробірках Falcon і культивували в тривимірній (3D) системі культирування гранул 39 протягом 14 днів у хондрогенному середовищі за наявності або відсутності різних SFA.

Для досліджень експлантатів великої рогатої худоби свіжі колінні суглоби великої рогатої худоби (n = 3) були отримані в день забою. Потім товщину суглобових хрящових експлантатів без субхондральної кістки збирали з колінних суглобів. Потім хрящові диски асептично розтинали за допомогою 4-мм шкірного штампу. Диски культивували в DMEM і додавали 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) та антибіотики при 37 ° C з 5% CO 2 протягом 48 годин.

Потім гранули та диски стимулювали кожним SFA (кінцева концентрація: 30 мкг/мл, отримана з аналізу MTT - дані не наведені). Негативний контроль, в якому не було додано SFA, обробляли лише транспортним засобом BSA. Для вивчення ефектів SFA та запальних цитокінів деякі гранули АСС та диски хряща великої рогатої худоби обробляли IL-1β (10 нг/мл) у присутності або відсутність різних SFA. Через 3 і 7 день середовища збирали і зберігали при -80 ° C для кількісного визначення сульфатованих глікозаміногліканів. Пізніше хрящові диски та гранули АСС були оброблені для гістологічного аналізу та кількісного ПЛР-аналізу в реальному часі (qPCR). Для подальшої оцінки відповідей на певні SFA до гранул хондроцитів додавали різні концентрації (10 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ і 90 мкМ) PA і SA як у відсутність, так і в присутності IL-1β (10 нг/мл ). Через 3 і 7 день середовища збирали і зберігали при -80 ° C для кількісного визначення сульфатованих глікозаміногліканів (sGAG). Крім того, для оцінки ефектів IL-1β, що використовувались у цьому дослідженні, гранули хондроцитів обробляли різними концентраціями IL-1β (1–10 нг/мл). День 3 та день 7 середовища збирали та зберігали при -80 ° C для кількісного визначення sGAG.

Аналіз сульфатованих глікозаміногліканів (sGAG)

Для вимірювання вивільнення sGAG супернатанти відбирали з лунок, що містять диски хряща великої рогатої худоби або гранули хондроцитів, оброблені SFA або без них у день 3 та день 7. SGAG вимірювали за допомогою методу диметилметиленового синього (DMB) із набором (Blyscan ™, Biocolor Ltd), дотримуючись інструкцій виробника. Зона виснаження sGAG в експлантатах хряща була визначена за допомогою зображень фарбування Safranin O та виміряна за допомогою ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Вилучення РНК та ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen), обробляли ДНКазою та очищали згідно з протоколом виробника за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen). кДНК синтезували з 1 мкг загальної РНК за протоколом виробника за допомогою набору синтезу кДНК SensiFAST. Кількісну ПЛР у реальному часі, використовуючи хімію виявлення SYBR Green, проводили на системі швидкого ПЛР ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster Сіті, Каліфорнія, США). Були проведені аналізи кривої розплаву всіх продуктів ПЛР у режимі реального часу, і було показано, що вони отримують єдиний дуплекс ДНК. Всі зразки вимірювали в трьох примірниках, а середнє значення всіх експериментальних зразків розглядали для порівняльного аналізу. Кількісні вимірювання всіх праймерів, що використовувались у цьому дослідженні, визначали методом (2 -ΔΔ Ct), а 18 с та експресію β-актину використовували як внутрішній контроль, як описано раніше нашою групою 39, 41, 42, 43 .

Статистика

Статистичний аналіз проводили за допомогою Graphpad Prism. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD) для всіх змінних та проаналізовані методом ANOVA. Для оцінки статистичної значущості використовували дисперсійний аналіз дисперсії із тестами post hoc (Dunnett's/Bonferroni). Рівень значущості був встановлений на рівні Р