предметів
реферат
Більше 40 років тому Ротвелл, Сток та його колеги продемонстрували, що дієти з низьким вмістом білка (ЛП) збільшують витрати енергії (ЕЕ) 1, 2. Подальша робота від Stock Lab показала, що дієти LP збільшують експресію гена Ucp1 як в BAT, так і в WAT 3, вказуючи на те, що залежний від UCP1 термогенез сприяв збільшенню ЕЕ. Нещодавно наша лабораторія створила ендокринний механізм для пояснення цієї білковозалежної регуляції ЕЕ, оскільки ми продемонстрували, що дієти з ЛП потребують гормону FGF21 для збільшення експресії ЕЕ та Ucp1 та зміни споживання їжі та збільшення ваги 4, 5. Ці дані узгоджуються з доказами того, що фармакологічне лікування FGF21 діє як у мозку, так і безпосередньо на жирову тканину, щоб збільшити ЕЕ, стимулювати симпатичний відтік та підвищити регуляцію термогенних маркерів у НДТ та ВАТ 6, 7, 8, 9, 10. Таким чином, активація FGF21-залежного сигналу терморегуляції є ключовим посередником метаболічних ефектів дієти з низьким вмістом білка.
Хоча FGF21 явно впливає на ЕЕ, ступінь необхідності збільшення UE1 від UCP1 для метаболічного ефекту FGF21 залишається незрозумілою. Деякі дослідження припускають, що FGF21 не вимагає UCP1 для збільшення EE 11, тоді як в інших дослідженнях видалення UCP1 послаблює ефект FGF21 12, 13. Враховуючи, що обмеження білка призводить до хронічної регуляції ЕЕ та ремоделювання жирової тканини 4, також видається можливим, що такі ефекти можуть змінити метаболічну відповідь на гострий стрес, і кілька попередніх досліджень припустили, що FGF21 може бути збільшений при холодовому стресі 7 14, 15, 16, 17, 18. Нарешті, також відомо, що обмеження білка, крім споживання ЕЕ 19, 20, збільшує споживання їжі. Що стосується енергетичного балансу, ця модель є незвичною, оскільки гормони енергетичного балансу (лептин) зазвичай підтримують суперечливі зміни в споживанні їжі та ЕЕ. Таким чином, здається можливим, що зміни в споживанні їжі та ЕЕ взаємопов’язані, або збільшення споживання їжі є адаптивною реакцією на підвищення ЕЕ (захист від втрати ваги), або, як варіант, збільшення ЕЕ є адаптивною реакцією на збільшення. при вживанні їжі (захист від набору ваги).
Тут ми описуємо серію досліджень, спрямованих на тестування взаємозв'язку між споживанням їжі, витратами енергії, UCP1 та FGF21 за допомогою моделі обмеження дієтичного білка. У цих дослідженнях індуковане LP збільшення ЕЕ вимагало як FGF21, так і UCP1. Однак, незважаючи на збільшення EE, FGF21 та UCP1, обмеження білка не впливало на температуру тіла та реакцію на гострий холодний стрес. Цікаво, що гіперфагія, спричинена LP, також не вимагала збільшення ЕЕ під час обмеження білка. У сукупності ці дані підтримують модель, в якій FGF21, індукований LP, зумовлює збільшення витрат енергії, залежне від UCP1, для впливу на метаболічні, але не термогенні кінцеві точки.
результат
Збільшення витрат енергії, зумовлене LP, відбувається в умовах термонейтральності і вимагає UCP1
Мишей Wildype та Ucp1-KO поміщали на контрольну та LP-дієту протягом 6 тижнів при 28 ° C, при цьому споживання енергії вимірювали протягом перших 7 днів (рис. 1A, B). Відповідно до наших попередніх досліджень, дієта LP давала значне збільшення ЕЕ у мишей дикого типу (с 
Низьке збільшення білка в споживанні енергії вимагає UCP1. Мишей дикого типу та Ucp1-KO поміщали на контрольну або LP-дієту (8/група) при 28 ° C, при цьому витрати енергії реєстрували протягом перших 6 днів на дієту. Споживання необробленого кисню (VO2) після переходу на контрольну або LP дієту у мишей дикого типу ( A ) та Ucp1- KO ( B ). Середня ЕЕ ( C. ), ЕЕ нормалізована до маси тіла D ), RER ( Е ) та активність ( F ) протягом 5 та 6 днів експерименту. * P
Видалення UCP1 збільшило втрату ваги через низький вміст білка, частково шляхом зміни ефекту низького вмісту білка на споживання їжі. Зміна маси тіла ( A ), середньодобове споживання їжі B ), жир ( C. ) і нежирна речовина ( D ) у мишей дикого типу та Ucp1-KO, які споживали контрольну або LP-дієту (8/група) протягом 6 тижнів при 28 ° C, * P # P
Вплив низького вмісту білка на FGF21 та експресію гена печінки та BAT у мишей Ucp1-KO. Тканини збирали у мишей дикого типу та Ucp1-KO після споживання контрольної або ЛП дієти (8/група) протягом 6 тижнів. Сироватку FGF21 вимірювали методом ІФА ( A ), тоді як експресія гена печінки Fgf21 ( B, C. ) та BAT ( D ) вимірювали методом ПЛР у реальному часі. * P + P # P 4, припускаючи, що вплив дієти LP може посилити метаболічну відповідь на гострий холодний стрес. Крім того, FGF21 був окремо пов’язаний як з реакцією на обмеження білка, так і з реакцією на холодний стрес, і, отже, втрата FGF21 повинна полегшити будь-який сприятливий ефект дієти LP. Для перевірки цього питання мишей дикого типу та Fgf21-KO поміщали на контрольну або LP дієту на 10 днів при кімнатній температурі (для підвищення ЕЕ у мишей WT), а потім піддавали гострому холодовому стресу (6 годин при 4 ° C без їжа). ). Відповідно до нашої попередньої роботи, LP-дієта призвела до значного зменшення маси тіла у мишей WT (с
Низький вміст білка, індукований FGF21, підвищує ЕЕ, але не змінює реакцію на гострий холодний стрес. Мишей WT та Fgf21-KO поміщали на дієту LP протягом 10 днів (10/група) при кімнатній температурі зі зміною маси тіла ( A ) та ректальної температури ( B ) вимірювали кожні два дні. На 10 день їжу виймали, а температуру знижували до 4 ° C протягом 6 годин з ректальною температурою ( C. ) та вимірювання ЕЕ ( D, E, F ). Сирий ЕЕ ( Е ) та ЕЕ були нормалізовані до маси тіла ( F ) протягом 24 годин до впливу холоду (23 ° C) та останні 3 години для впливу холоду (4 ° C). Сірий відтінок на панелі D відображає вимкнене світло, а синій відбиває час впливу холоду. * P
Вплив дієти з низьким вмістом білка та делеції FGF21 на кінцеві точки метаболізму після гострого холодного стресу. Мишей WT та Fgf21 -KO поміщали на LP на 10 днів, а на 10 день їжу видаляли і температуру знижували до 4 ° C. Мишей забивали через 6 годин при 4 ° C та вимірювали FGF21 у сироватці крові ( A ), печінкова мРНК Fgf21 ( B ), печінка ( C. ) та BAT ( D ) експресія мРНК. 10/група. * P
Гіперфагія не потрібна для збільшення витрат білка з низьким вмістом білка. Мишей дикого типу поміщали на контрольну або ЛП дієту на добу на 7 днів або поміщали на ЛП, але годували щоденним споживанням контрольної групи (LPPF) для запобігання гіперфагії. Щоденне споживання їжі ( A, B ), маса тіла на 0 день ( C. ) і день 7 ( D ) і зміна ЧБ протягом 7 днів ( Е ). Некориговані середньодобові витрати енергії ( F ) і в середньому за 5 7 днів ( G ) та ЕЕ з урахуванням маси тіла на 7 день ( H a Я ). 8 мишей/група. * P # P 1, 2, 19, 21, 22, 23, 24. Нещодавня робота в нашій лабораторії та інших дослідженнях показує, що ендокринний гормон FGF21 збільшується за рахунок обмеження білка і необхідний для цих змін 4, 5, 25, 26, 27, 28, 29. Однак залишається ще декілька запитань щодо механізму, за допомогою якого FGF21 діє в контексті обмеження білка, і чи викликані ці FGF21-залежні ефекти на споживання їжі, ЕЕ та масу тіла незалежно один від одного чи взаємопов'язані.
Разом ці дані привели до чотирьох важливих висновків. (1) Відповідно до нашої попередньої роботи, LP-дієта збільшує FGF21 і FGF21 необхідний для метаболічних реакцій на дієту LP. (2) Збільшення ЕЕ, спричинене LP, вимагає UCP1, а втрата UCP1 змінює ефект харчування дієти LP, (3) Незважаючи на збільшення кількості набору EE та UCP1, залежне від FGF21, ні дієта LP, ні видалення FGF21 не впливають на адаптивну реакцію на гострий холодний стрес і, нарешті, (4) індукція ЕЕ, здається, є основною адаптаційною реакцією на обмеження білка, тоді як збільшення загального споживання їжі, здається, є вторинним щодо збільшення ЕЕ. Таким чином, ці дані підтримують модель, в якій FGF21, індукований LP, контролює енергетичну залежність UCP1, впливаючи тим самим на метаболічні, але не термогенні кінцеві точки.
Матеріали і методи
Тварини та дієти
Експериментальний дизайн
Експеримент 1: Вплив обмеження білка на мишей з дефіцитом Ucpl, утримуваних у термонейтральності
Самці мишей дикого типу та Ucp1-KO (
3-місячного віку) поміщали на контрольну або LP-дієту протягом 6 тижнів (8 мишей/дієта/генотип) і поміщали при 28 ° C протягом усього періоду дослідження. Початкова дієта проводилася в метаболічних камерах (Oxymax, Columbus Instruments), через 1 тиждень тварин переводили в стандартне утримання. Миші залишались на дієті протягом 6 тижнів, при цьому вага тіла та споживання їжі вимірювали щотижня. Склад тіла вимірювали за допомогою TD-ЯМР (Bruker Minispec) на початку експериментальної дієти (день 0), в останній день метаболічного аналізу OxyMax (день 7) і в день жертви (день 42).
Експеримент 2: Вплив обмеження білка та холодного стресу на мишей з дефіцитом Fgf21
Самці мишей дикого типу та Fgf21-KO брали участь у дослідженні приблизно у віці 3 місяців та утримувались при кімнатній температурі (23 ° C), поміщалися на контрольну або LP дієту протягом 10 днів (10 мишей/дієта/генотип) та їжа. споживання, маса тіла та ректальна температура реєструються кожні 2 дні. На 9 день половину мишей у кожній групі помістили в метаболічні камери для реєстрації вихідного ЕЕ при 23 ° C. На 10 день температура утримання у всіх мишей була знижена до 4 ° С протягом 6 годин, починаючи з 11:00, при EE, зафіксованому у мишей в метаболічних камерах, і ректальні температури реєстрували кожні 30 хвилин для решти мишей. Через 6 годин мишей забивали і тканини збирали, як описано вище.
Експеримент 3: Вплив спарювання на індуковане LP збільшення витрат енергії у мишей дикого типу
У віці 3 місяців самців мишей дикого типу випадковим чином розподіляли на три групи лікування і годували контрольною або ЛП дієтою, або годували ЛП дієтою, але годували щоденним споживанням контрольної групи (щоб уникнути гіперфагії, спричиненої ЛП) . ). Мишей годували цими дієтами протягом 7 днів, при цьому весь експеримент проходив у метаболічних камерах (23 ° C) для оцінки змін витрат енергії. Споживання їжі вимірювали щодня, вимірюючи масу тіла та склад на початку (день 0) та наприкінці (день 7) експерименту.
Визначення імунологічного аналізу FGF21
Концентрації FGF21 у сироватці крові визначали у мишей методом ІФА згідно з рекомендацією виробника (№ RD291108200R, ІФА для мишей та щурів FGF-21, BioVendor). Мінімальна виявляється концентрація FGF21 за допомогою цього аналізу становила 18,4 пг/мл. Для визначення сироваткового FGF21 перед аналізом 50 мкл сироватки розводили у 200 мкл розчинного буфера.
ПЛР у режимі реального часу
Екстракцію РНК та ПЛР у реальному часі проводили, як описано вище 42. Загальну РНК екстрагували з печінки, iWAT та BAT з використанням реагенту TRIzol відповідно до протоколу виробника (Invitrogen), з додаванням набору для аналізу тканин RNeasy Lipid (Qiagen) для BAT & iWAT. Чистоту та кількість РНК визначали спектрофотометрично за допомогою NanoDrop (Thermo Scientific). Синтез CDNA проводили за допомогою iScript (BioRad), і мРНК визначали кількісно на платформі ABI 7900, використовуючи ABI SYBR Green PCR Master Mix в 384-лункових оптичних пластинах (Applied Biosystems). Пари праймерів були розроблені за допомогою інструмента IDT RealTime qPCR Primer Design з принаймні одним праймером, що перетинає межу екзон-екзон. Експресія цільового гена нормалізувалась за допомогою циклофіліну як ендогенного контролю. Використовуються такі праймери, написані від 5 'до 3':
Fas pre GGGATCTGGTGAAAGCTGTAG; Rev GTGTTCTCGTTCCAGGATCTG
Scd-1 для CTGTACGGGATCATACTGGTTC; Рев. CGTGCCTTGTAAGTTCTGTG
Srebp1 Для AGATTGTGGAGCTCAAAGACC; Rev CACTTCGTAGGGTCAGGTTC
Klb Pre CAGGGATATCTACATCACAGCC; Rev GTAGCCTTTGATTTTGACCTTGTC
Fgf21 Для CAAATCCTGGGTGTCAAAGC; Rev CATGGGCTTCAGACTGGTAC
Fgfr1 Для AAAGATCTGGTATCCTGTGCC; Версія TCGAGCTAAGCCAAAGTCTG
Fgfr4 Для TGTCAAATTCCGCTGTCCAG; Rev ACCACACTTTCCATCACCAG
Cyc Pre CTTCGAGC TGTTTGCAGACAAAGT; Rev AGATGCCAGGACCTGTATGCT.
Статистичний аналіз
Дані аналізували за допомогою програмного пакету SAS (SAS V9, SAS Institute), використовуючи односторонні, двосторонні або повторювані вимірювання ANOVA, використовуючи загальну процедуру лінійної моделі. Коли експериментальні широкомасштабні випробування були значущими, проводили порівняння після закінчення з використанням заяви LSMEANS з опцією PDIFF і представляли найменш значущі відмінності в тестах для попередньо запланованих порівнянь. Усі дані виражаються як середнє значення ± SEM, з імовірністю 0,05 вважається статистично значущим.
Наявність даних
Файли даних, створені та/або проаналізовані під час поточного дослідження, можна отримати у відповідного автора за обґрунтованим запитом.
Дякую
Автори хотіли б, щоб Мадлен Денер, Лексус Тросклер та співробітники PBRC компанії Comparative Biology Core за майстерну допомогу та чудову технічну підтримку. Ми також дякуємо Dr. Томасом Геттісом та його лабораторією для мишей Ucp1-KO та за корисні обговорення під час підготовки цього рукопису. Цю роботу підтримали NIH R01DK081563 та R01DK105032 на CDM. CMH підтримувався Адміністративною добавкою NIH R01DK105032-01A1S1. TL був підтриманий дослідницьким перебуванням у Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) LA 3042/2-1. HRB підтримувався R01DK047348, а HM - R01DK092587. Цей проект/робота був використаний установами в ядрі метаболізму та поведінки тварин, ядром біології генома та клітини та біозображенням ядра в PBRC, які частково підтримуються грантами COBRE (P30GM118430) та NORC (P30DK072476) від Національного інституту охорони здоров’я.
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.