предметів
реферат
Гепатоцелюлярна карцинома (ГЦК) є п’ятою за поширеністю злоякісною пухлиною та другою провідною причиною смерті від раку у всьому світі1. Було докладено багато зусиль для поліпшення клінічного ведення пацієнтів з ГХК; Однак поточний прогноз HCC слабкий, головним чином через високі показники метастазування та рецидивів, що призводить до низької загальної виживаності 2. Відсутність ефективних терапевтичних засобів вимагає термінової розробки нових препаратів для лікування прогресивного HCC.
Анізоміцин - це антибіотик, вироблений Streptomyces griseolus 15, 16. Цікаво, що було показано, що анізоміцин пригнічує синтез еукаріотичних білків та синтез ДНК, і, як повідомляється, він має прямий вбивчий ефект на декілька типів пухлинних клітин 17, 18. Однак механізми, що лежать в основі протипухлинних ефектів, пов'язаних з імунною системою анізоміцину, не досліджені.
результат
Анізоміцин діє як потужний прямий цитотоксичний засіб проти клітин HCC
Хоча про протипухлинну цитотоксичну дію анізоміцину (див. Хімічну структуру на малюнку 1а) раніше повідомлялося в 17, 18, пряма цитотоксична здатність анізоміцину в клітинах HCC не описана. Таким чином, ми дослідили цитотоксичність анізоміцину в декількох клітинних лініях HCC. Щоб оцінити цей стан, ми виміряли прямий вплив анізоміцину на життєздатність та проліферацію клітин HepG2, Huh7 та SNU449, використовуючи аналізи життєздатності EZ-Cytox Enhanced. Значення напівмаксимальної інгібуючої концентрації (IC50) для опосередкованої анізоміцином клітинної цитотоксичності розраховували за відповідними кривими концентрація-відповідь. Важливо, що всі клітини HepG2, Huh7 та SNU449 були чутливими до анізоміцину (значення IC50 для клітин HepG2, Huh7 та SNU449: 82, 2, 118 та 138 нМ відповідно; Рис. 1b-d). Наші результати свідчать про те, що анізоміцин є високоефективним у пригніченні клітин HCC. Для підтвердження цитотоксичної дії анізоміцину ми досліджували клітини HepG2, Huh7 та SNU449 після культивування 0,2 мкМ анізоміцину протягом 2 днів. Ми виявили, що анізоміцин зменшував щільність клітин ліній клітин HepG2, Huh7 та SNU449, як це спостерігали за допомогою світлової мікроскопії (рис. 1д).
Інгібуюча дія анізоміцину на клітини HCC. a ) хімічна структура анізоміцину; % інгібування клітинної проліферації внаслідок лікування анізоміцином у ( b ) HepG2, ( c ) Huh7 a ( d ) Клітини SNU449 визначали, а дані об’єднували в результаті трьох незалежних експериментів. Вказані значення IC50 визначали з кривої концентрація-відповідь. ( e Клітини HepG2, Huh7 та SNU449 обробляли DMSO (контроль) або 0,2 мкМ анізоміцину протягом 48 годин, і фотографії робили під світловим мікроскопом. Показані репрезентативні зображення з більш ніж трьох незалежних експериментів.
Повнорозмірне зображення
Анізоміцин викликав селективну експресію генів, пов’язаних з апоптозом та імунною відповіддю в клітинах HCC
Анізоміцин викликав апоптоз і регулював гени, пов’язані з апоптозом у клітинах HCC. ( a ) Діаграми Венна показ кількість диференційовано експресованих генів, пов'язаних з апоптотичним процесом та імунною відповіддю, регульованою в клітинах HepG2 після обробки анізоміцином. Серед 1821 гена, що використовуються для аналізу функціональної анотації DAVID, 166 та 127 гени були визначені як асоційовані гени для апоптотичного процесу та імунної відповіді. З обох сторін було включено 39 генів. ( b ) Представлення теплової карти рівнів експресії генів, асоційованих з апоптозом, які були змінені більш ніж у 2 рази після обробки клітин HepG2 анізоміцином у трьох незалежних експериментах. Список генів для цієї теплової карти наведено в Додатковій таблиці 1. ( c Клітини HepG2, Huh7 та SNU449 попередньо обробляли DMSO (контроль), 0, 1 та 0,2 мкМ анізоміцину протягом 48 годин, а апоптоз аналізували за допомогою проточної цитометрії. -ADD (апоптотичні клітини) з трьох незалежних експериментів.
Повнорозмірне зображення
Індукований анізоміцином апоптоз у клітинах HCC
Теплова карта генів, пов’язаних з апоптозом (рис. 2b), показала, що експресія 90 генів була надрегульованою, тоді як експресія 76 генів була знижена (перерахована в додатковій таблиці 1). Таким чином, ми спробували підтвердити, чи не викликав анізоміцин апоптотичну загибель клітин у клітинах HCC. Спочатку ми забарвлювали клітини HepG2, оброблені анізоміцином, анексином V та 7-ADD, а потім проводили проточну цитометрію. Ми виявили, що частка апоптотичних клітин HepG2 (позитивні до анексину V та позитивні до 7-ADD) зростала із збільшенням концентрації анізоміцину (рис. 2в). Подібний вплив на апоптоз також спостерігався в клітинах Huh7 та SNU449 після обробки анізоміцином у концентраціях, показаних на фіг. 2в.
Анізоміцин підвищував цитотоксичність NK-клітин у клітинах HCC in vitro
NK-залежні ефекти анізоміцину в моделі ксенотрансплантата HCC. a ) Принципова схема проекту дослідження та способу ін'єкції для терапевтичної ефективності. ( b ) Через п'ять днів після інокуляції клітин HepG2 анізоміцин (10 мг/кг) вводили від 0 до 5 днів та від 15 до 20 днів після початку внутрішньочеревного (ip) лікування. NK-клітини (5 x 10 6 клітин/миша) переносили мишам двічі на 6 і 11 день протягом періоду паузи лікування, як описано в Матеріали та методи (n = 6 мишей). Розміри пухлини вимірювали у зазначені дні. ( c ) Пухлини в кожній групі мишей (n = 6) на 23 день експерименту. ( d ) Точки маси тіла кожної групи мишей (n = 6) вимірювали кожні 3 дні.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Анізоміцин, природний антибіотик, виділений з S. griseolus 15, 16, має інгібуючу дію на еукаріотичні рибосоми, блокуючи активність пептидилтрансферази 24. Ця активність анізоміцину в еукаріотів може впливати на різні клітинні функції, такі як регулювання експресії білка, виживання та проліферації 18, 25, 26. Крім того, опосередковані анізоміцином ефекти можуть бути опосередковані регуляцією внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, таких як активована мітогеном протеїнкіназа (MAPK) шлях 26, що зменшує інгібітор каспази, пов’язаний з ферментом, що перетворює домен c-Fas (IL-1). інгібуючий фермент. білок (FLIP) та шлях активації смерті активації 27, 28 та активації c-Jun та p-38 кінази 29, 30. Зрозуміло, що анізоміцин викликає множинні сигнали проти раку в різних ракових клітинах, включаючи клітини HCC. Сигнальні шляхи, що викликаються анізоміцином, можуть відрізнятися між різними клітинами через диференційовані внутрішньоклітинні сигнальні ліси, які відрізняються між різними клітинами. Хоча ще не до кінця зрозумілий, анізоміцин однозначно впливає на клітинний сигнал смерті.
На основі нашого аналізу геномної транскрипції з використанням Кіотської енциклопедії генів і геномів ми виявили, що анізоміцин у клітинах HCC може впливати на багато сигнальних шляхів, включаючи MAPK, рецептор фактора некрозу пухлини та сигнальні шляхи ядерного фактора kappap. (дані не відображаються). Ці ефекти анізоміцину на внутрішньоклітинні сигнальні шляхи можуть індукувати апоптоз і пригнічувати ріст клітин HCC. Дійсно, наші результати показали, що анізоміцин має сильний інгібуючий вплив на ріст або пряму цитотоксичність у кількох клітинних лініях HCC; крім того, ці інгібуючі ефекти анізоміцину можуть бути зумовлені індукцією апоптозу в клітинах HCC. Таким чином, зміни множинних внутрішньоклітинних сигналів, індуковані анізоміцином, можуть пояснити апоптоз клітин та цитотоксичність у клітинах HCC.
Серед імуноасоційованих генів ми також виявили, що гени CD46, Vav3, ITGB2, EMP2 та ECM1 у клітинах HepG2 були знижені за допомогою анізоміцину; Раніше повідомлялося, що ці гени виконують функції метастазів у клітинах у різних клітинних лініях раку 33, 34, 35, 36. Інша важлива група імуноасоційованих генів, регульованих анізоміцином, включає KITLG, IL-6, IL-32 та IL-3RA, які кодують цитокіни та цитокінові рецептори для опосередкування потенційних сигналів виживання або росту в клітинах пухлини. Важливо, що більшість генів цитокінів та рецепторів цитокінів були знижені за допомогою лікування анізоміцином у клітинах HepG2. Зниження регуляції цитокінів та цитокінових рецепторів може пригнічувати функції цитокінів або інших факторів росту, викликаючи сигнали виживання синергетично зі зменшенням цитокінових внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, таких як STAT5B, IRAK2, RELB та JAK3 .
методи
Миші NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl були придбані у Charles River Laboratories, Inc. (Вілмінгтон, Массачусетс, США). У всіх експериментах ми використовували 6-8-тижневих самок мишей; ці миші були розміщені в приміщенні для тварин, що не має патогенів. Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з питань благополуччя та догляду за тваринами Кореї при Науково-дослідному інституті біологічних наук та біотехнологій у Кореї та проводились відповідно до Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, виданого Національним інститутом охорони здоров’я США.
Вивчення ксенотрансплантатів
6-тижневу самку мишей NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl придбали у Charles River Laboratories, Inc. Моделі ксенотрансплантата визначали шляхом підшкірної ін’єкції 1 x 10 6 клітин HepG2 у праві боки мишей. Через п’ять днів після щеплення мишей випадковим чином розділили на групи по чотири особи. Анізоміцин (10 мг/кг) вводили з 0 по 5 день та з 15 по 20 день після початку лікування анізоміцином внутрішньочеревно (ip). NK-клітини (5 х 106 клітин/миша) переносили мишам двічі на 6 та 11 день протягом періоду паузи лікування. Пухлини вимірювали кожні 3 дні за допомогою штангенциркулів та їх обсяги розраховували за такою формулою: об'єм (мм3) = (d2xD)/2, де d і D являють собою найкоротший та найдовший діаметр пухлини відповідно.
Класифікація периферичної крові та NK-клітин людини
Периферичну кров від здорових донорів отримували з центру крові Червоного Хреста. Ми виконували вказівки Червоного Хреста, і всі методи та протоколи, що стосуються використання периферичної крові людини, були схвалені Інституційною комісією з огляду Червоного Хреста. На підставі рекомендацій Червоного Хреста була отримана поінформована згода на участь у дослідженні, а інформація про донорів не надавалась. Клітини NK виділяли з цільної крові до чистоти понад 95% шляхом негативного відбору з використанням коктейлю збагачення клітин NK RosetteSep людини (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада) згідно з протоколом виробника. Ізольовані NK-клітини промивали HBSS плюс 4% фетальної бичачої сироватки (FBS; Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США) і ресуспендували в MEM (Life Technologies), що містить 20% FBS (Life Technologies) та пеніцилін-стрептоміцин (Life Technologies ) при 37 ° C у 5% CO 2.
Аналіз цитотоксичності NK-клітин
Культура клітин та реагенти
Клітини HepG2 були придбані в American Type Culture Collection (ATCC, Манассас, штат Вірджинія, США), а клітини Huh7 та клітини SNU449 - у Корейського банку лінійних ліній (Сеул, Корея). Клітини культивували відповідно до вказівок постачальника. Клітини HepG2 культивували в мінімальному основному середовищі Eagle (ATCC), що містить 10% FBS (Life Technologies), 2 мМ 1-глутаміну та пеніцилін-стрептоміцин (Life Technologies) при 37 ° C у 5% CO 2. Клітини Huh7 та SNU449 культивували в RPMI1640 (Life Technologies), що містить 10% FBS (Life Technologies), 2 мМ 1-глутаміну та пеніцилін-стрептоміцин (Life Technologies) при 37 ° C у 5% CO 2. Анізоміцин був придбаний у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США) і розчинений у концентрації 20 мг/мл у 100% ДМСО у вигляді основного розчину. Вихідний розчин зберігали при -20 ° C і розводили в середовищі перед кожним експериментом. Кінцева концентрація DMSO не перевищувала 0,1% під час цього дослідження (всі контрольні групи отримували 0,1% DMSO). Антитіла до каспази 3, PARP та β-актину були придбані у Cell Signaling Technology (Danvers, MA, США).
Мікрочипи та аналіз даних
Аналізи життєздатності та проліферації клітин
Проліферацію клітин оцінювали за допомогою набору для аналізу життєздатності клітин EZ-Cytox від ITSBIO (Сеул, Республіка Корея). Коротко кажучи, відповідну кількість клітин поміщали в кожну лунку 96-лункового планшета і піддавали впливу різних концентрацій анізоміцину протягом 48 годин. Згодом додавали реагент солі тетразолію і клітини інкубували протягом 2 годин. В кінці інкубації поглинання в кожній лунці вимірювали при 450 нм за допомогою зчитувача мікропланшетів. Відносну життєздатність клітин (%) розраховували за допомогою рівняння OD T/OD Cx 100% (де ODT являє собою поглинання в групі, яка отримувала лікарські засоби, а ODc являє собою поглинання в контрольній групі). Середню інгібуючу концентрацію (IC50) визначали як концентрацію лікарського засобу, необхідну для інгібування 50% клітин, порівняно з контролем. Значення IC50 визначали з кривої концентрація-відповідь.
Антитіла та проточна цитометрія
Для аналізу апоптотичних клітин клітини фарбували моноклональними антитілами до людського CD56-аллофікоціаніну, 7ADD та Анексину V (BioLegend, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) згідно з протоколом, наданим виробником. Коротко кажучи, клітини фарбували моноклональними антитілами проти людини CD56-аллофікоціанін на льоду протягом 10 хвилин, промивали відповідним об'ємом охолодженого буфера зв'язування анексину V (BioLegend) і ресуспендували в охолодженому охолоджувальному буфері анексину V (BioLegend). наявність анексину V та 7ADD. Клітини інкубували на льоду протягом 30 хвилин, промивали охолодженим буфером для зв’язування анексину V та аналізували. Дані фарбування збирали за допомогою цитометра FACSCanto II (BD Biosciences).
Сортування комірок
Клітини HepG2 культивували у присутності або відсутність 0,2 мкМ анізоміцину протягом 2 днів і збирали для підрахунку клітин. Потім 1 х 107 клітин HepG2 спільно культивували з 1 х 107 NK клітинами протягом 2 годин і збирали центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 5 хвилин. Клітини фарбували моноклональними антитілами CD56 проти людини (BioLegend), промивали і ресуспендували в PBS, що містить HBSS, доповнений 4% FBS (Gibco). CD56-негативні клітини HepG2 виділяли майже до 100% чистоти за допомогою цитометра Aria (BD Biosciences).
Виділення загальної РНК та ланцюгової реакції полімеразної зворотної транскрипції (qPCR)
Клітини готували, як описано вище. Загальну клітинну РНК виділяли за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen). RT-PCR у реальному часі проводили з використанням РНК (20 нг) як шаблону, кДНК qScript SuperMix для етапу зворотної транскрипції та PerfeCTa qPCR FastMix, UNG та ROX для ПЛР (Quanta Biosciences, Гейтерсбург, штат Медіка, США). Набори праймерів та зондів (з маркуванням FAM/VIC) були придбані у компанії Applied Biosystems (Waltham, MA, USA). Результати нормалізували на основі значень, отриманих для GAPDH, як було виявлено за допомогою контрольних реагентів TaqMan GAPDH (Applied Biosystems). QPCR у режимі реального часу проводили на повторюваних зразках із застосуванням системи виявлення послідовності ABI 7700 (Applied Biosystems). Для клітин від кожного донора відносні рівні експресії на основі значень 2-ACT виражаються у відсотках щодо значень, отриманих для підгрупи з найвищим вираженням.
Вестерн-блот-аналіз
Клітини суспендували у модифікованому буфері для лізису RIPA (150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолату натрію, 0,1% додецилсульфату натрію [SDS] і 50% мМ трис- HCl [pH 7,4], що містить коктейль-інгібітор протеази (Рош, Мангейм, Німеччина) та інгібітори фосфатази (1 мМ фторид натрію та 2 мМ ацетат ртуті натрію) на льоду протягом 30 хвилин і центрифугують при 15000 xg протягом 30 хвилин для отримання лізатів цілих клітин . Потім білки (10-20 мкг) розділяли за допомогою SDS-поліакриламідного гелевого електрофорезу на 8-12% гелів і переносили в мембрани полівінілідендифториду (Millipore, Bedford, MA, USA). Вестерн-блотинг проводили з первинними антитілами проти каспази 3, PARP та β-актином (Cell Signaling Technology) та кон’югованими з пероксидазою антимишачими або кролячими вторинними антитілами. Білки візуалізували за допомогою реагентів Enhanced Chemiluminescence Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, США).
Статистичний аналіз
Для багаторазового порівняння використовували дисперсійний аналіз. Неспарені t-тести були проведені для аналізу відмінностей між двома групами. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного пакету Prism (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Відмінності зі значеннями р 0,05 або менше вважалися значущими.
Дякую
Ця робота була підтримана грантом Національної урядової дослідницької ради з питань науки і техніки (NST) (MSIP; номер гранту CRC-15-02-KRIBB).
Електронний додатковий матеріал
Додаткова інформація
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.