Рекомендувати документи

екзамен

Можливості та значення окисно-відновного гомеостазу в дослідженнях на людях та тваринах

Докторська дисертація 2003

Автор: Університет Кочіса Іболі Земмельвейса, медичний факультет, II. Клініка внутрішніх хвороб Будапешта

Підготував: Докторська школа Університету Земмельвейса, клінічна медицина, 2-й кандидат наук

Керівник докторської школи: Дисципліна д-р проф. Д-р Жолт Тулассе Керівник програми: проф. Д-р Янош Фехер Керівник: д-р Анна Блазовіч

ЗМІСТ. 2 СПИСОК СКОРОЧЕНЬ. 6 1.

1.1. Окисно-відновний гомеостаз організму. 7 1.1.1. Процеси, що забезпечують антиоксидантний баланс. 7 1.1.2. Роль окисного стресу в патомеханізмі захворювань. 9 1.2. Антиоксиданти природного походження. 12 1.2.1. Роль природних препаратів у окисно-відновному гомеостазі, вплив вмісту мікроелементів на розвиток антиоксидантної дії. 12 1.2.2. Raphanus sativus (L.) var. нігер. 13 1.2.3. Cichorium intybus (L.). 14 1.2.3.1. Поліфенольні сполуки: флавоноїди, похідні кавової кислоти. 14 1.2.3.2. Значення фруктоолігосахаридів у підтримці здорової функції шлунково-кишкового тракту. 16 1.2.4. Ліки з Далекого Сходу. 19 1.2.4.1. Препарати чаю Бейцишен. 19 1.3. Можливості дослідження при дослідженні окисно-відновного балансу живого організму, їх можлива роль у діагностиці. 22 1.3.1. Сучасні засоби та методи клінічних досліджень вільних радикалів. 22 1.3.1.1. Можливості тестування антиоксидантного статусу. 24 1.3.1.1.1. Спектрофотометричні та ферментативно-колориметричні методи. 24 1.3.1.1.2. Методи вимірювання, засновані на виявленні флуоресценції та люмінесценції. 28 1.3.1.2. Параметри випробування на окисні пошкодження. 30 1.3.1.2.1.

Перекиси ліпідів, гідропероксиди ліпідів. 30

Продукти від пошкодження ДНК. 33

1.3.1.2.4. Окислення білків, виявлення білкових карбонільних груп та їх патофізіологічне значення. 34 1.3.1.3. Інші, менш поширені методи випробувань. 35 1.3.2. THE

3.1. Хімічні аналітичні методи. 39 3.1.1. Методи, що використовуються для вивчення вільнорадикальних реакцій. 39 3.1.1.1. Дослідження загальної ємності поглинача за допомогою люмінометрії. 39 3.1.1.2. Визначення зменшувальної потужності. 39 3.1.1.3. Визначення активності H-донора. 40 3.1.1.4. Загальний антиоксидантний статус. 40 3.1.1.5. Визначення дієнового кон'югату. 41 3.1.1.6. Вільні сульфгідрильні групи. 41 3.1.2. Визначення метаболітів. 41 3.1.3. Визначення активності ферментів. 43 3.2. Інші визначення. 46 3.2.1. Вміст білка в біологічних зразках. 46 3.2.2. Вміст гемоглобіну в гемолізаті еритроцитів. 46 3.2.3. Фітохімічні аналізи. 46 3.2.3.1. Визначення загальних поліфенолів. 46 3.2.3.2. Вміст флавоноїдів. 46 3.2.3.3. Визначення кавової кислоти. 46 3.2.3.4. ВЕРХ-аналіз. 47 3.2.4. Визначення вмісту мікроелементів. 47 3.2.4.1. За рослинним візерунком. 48 3.2.4.2. Виготовлений з тканини тварини. 48 3.3. Приготування рослинних екстрактів. 48 3.3.1. Сік чорної редьки. 48 3.3.2. Екстракт цикорію. 48 3.3.3. Чай Beiqishen. 49 3.4. Експерименти на тваринах. 49 3.4.1. Дієтичні групи тварин, що використовуються. 49 3.4.2. Лікування. 49

3.4.2.1. Лікування пресом чорної редьки. 49 3.4.2.2. Лікування екстрактом цикорію. 49 3.4.2.3. Лікування приготуванням чаю Beiqishen. 50 3.4.3. Підготовка органів до обстеження. 50 3.4.3.1. Приготування гемолізатів сироватки, плазми та еритроцитів. 50 3.4.3.2. Приготування гомогенатів печінки та підшлункової залози. 51 3.4.4. Морфологічні дослідження. 51 3.5. Дослідження окисного стресу при деяких захворюваннях (дослідження на людях). 3.5.1. Пацієнти із запальними захворюваннями кишечника. 52 3.5.2. Люди з неалкогольним стеатогепатитом. 52 3.5.3. Люди з діабетом. 52 3.6. Матеріали. 52 3.7. Математичний статистичний аналіз. 53

4.1. Вплив соку чорної редьки на сироваткові параметри щурів Вістар. 54 4.1.1. Дослідження in vitro антиоксидантних властивостей соку преса. 54 4.1.2. Дослідження впливу пресового соку при експериментальній гіперліпідемії. 55 4.2. Вплив екстракту цикорію на вуглеводний та жировий обмін. 58 4.2.1.

Дослідження in vitro антиоксидантних властивостей екстракту цикорію. 58

4.2.2. Вплив лікування цикорієм у щурів Wistar з експериментальною гіперліпідемією. 60 4.2.2.2. Дослідження зразків гомогенату печінки. 62 4.2.2.3. Гістологічне дослідження тканини печінки. 65 4.2.3.

Вплив лікування цикорієм у щурів Фішера з гіперліпідемією. 66

4.2.3.1. Зміни функції печінки у сироватці крові та показників ліпідного обміну. 66 4.2.3.2. Дослідження зразків гомогенату печінки. 68 4.2.3.3. Випробування в гомогенаті тканин підшлункової залози. 69 4.2.3.4. Гістологічне дослідження тканини печінки. 70 4.3. Вплив чаю Beiqishen на гомеостаз у здорових щурів Wistar. 72 4.3.1. Складові чаю Beiqisen. 72 4.3.2

Зміни показників сироватки крові (ферменти, метаболіти). 72

Зміни параметрів червоного вола в гомогенаті печінки. 73

Визначення вмісту мікроелементів у гомогенаті печінки. 76

4.4 Зміни параметрів окисно-відновного гомеостазу при захворюваннях людини. 78 4.4.1

При запальних захворюваннях кишечника. 78

При безалкогольному стеатогепатиті. 84

Результати моніторингу діабету. 89

5.1. Експерименти на тваринах. 92 5.1.1. Вплив соку чорної редьки при гіперліпідемії. 92 5.1.2. Вплив дієтичних добавок з екстрактом цикорію на нормальну та жирну дієту. 94 5.1.3. Висновки щодо випробування на чаї Beiqisen на тваринах. 96 5.2. Значимість досліджень, що характеризують окисно-відновний гомеостаз. 98 5.2.1. Окисно-відновний гомеостаз запального захворювання кишечника. 98 5.2.2. Окисно-відновний стан при безалкогольному ураженні печінки. 100 5.2.3. Можливості окисного моніторингу діабету. 101 6.

СПИСОК ВЛАСНИХ ОГОЛОШЕНЬ. 128

ліпопротеїни високої щільності

високоефективна рідинна хроматографія

Запальні захворювання кишечника

інсулінозалежний цукровий діабет

інсулінонезалежний цукровий діабет

відносна одиниця освітленості (хемілюмінесцентна інтенсивність світла)

загальний антиоксидантний статус

Статистичні скорочення: X

Я написав іноземні терміни в дисертації відповідно до рекомендацій Угорської академії наук.

1.1. Окисно-відновний гомеостаз організму 1.1.1. Процеси, що забезпечують антиоксидантний баланс Паралельно з постійним розвитком біохімічних та фізико-хімічних методів, наші знання про фізіологічні процеси в організмі та їхній молекулярний фон поглиблюються з кожним днем. До кінця 1990-х років, з кращим розумінням біологічної ролі хімічних реакцій на основі окисно-відновного переносу електронів, вільних радикалів, що утворюються в реакціях, реактивних проміжних сполук кисню, концепція "стресу" Селлі як базового поняття розширилася до "окисного стресу" і майже нове значення, отримане при поясненні фізіологічних процесів, розумінні розвитку хвороб (109). За останні п’ять років новий напрямок досліджень досліджував процеси окисного відновлення на клітинному рівні, іноді із селективним впливом на міжклітинний механізм сигналізації (84). Здатність антиоксидантів запобігати окислювальним пошкодженням стає все більш очевидною завдяки дослідженням етапів передачі сигналу. З точки зору їх ролі в реакціях переносу електронів у фізіологічних процесах, антиоксиданти

(коерулоплазмін, альбумін, феритин, міоглобін, трансферин, металотіоїн) запобігають утворенню реактивних проміжних сполук кисню. «Поглиначі», тобто антиоксиданти, що поглинають радикали, прагнуть нейтралізувати надзвичайно швидко і реакційноздатні, непарні

тим самим запобігаючи ланцюгову реакцію (ініціацію), інакше ініційовану радикалами. Остання група включає ряд природних малих молекул (вітаміни, сполуки, що містять групу вільного SH, аміни, тіоли, хіноліни тощо). ферменти. До ферментів належать, крім супероксиддисмутази, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, каталази та т.зв. металоферменти, які перетворюють та усувають надлишок вільних радикалів, усуваючи тим самим їх потенційну шкідливу дію на ліпіди та білки. Завдяки властивостям донорів протонів низькомолекулярні сполуки відіграють важливу роль у нейтралізації радикалів, напр. глутатіон, аскорбінова кислота, токоферол, білірубін, сечова кислота (продукт розпаду нуклеотидів) або навіть каротиноїди, флавоноїди як сполуки рослинного походження, активні інгредієнти (164). Що стосується їх розчинності, як у воді, так і в

сильно залежить від напруги кисню. Діє як антиоксидант при тиску кисню 15-20 торр і як прооксидант при тиску 760 торр (144, 162).

1.1.2. Роль окисного стресу в патомеханізмі захворювань

утворюються активні форми кисню

пацієнтів. Під час дворічного спостереження ангіографічні обстеження показали зменшення прогресування ішемічної хвороби (86, 125). Продовжуючи спектр захворювань, роль реактивних проміжних сполук кисню у запальних захворюваннях суглобів (158), запальних захворюваннях кишечника (18, 184, 166), пухлинних процесах (109, 207), захворюваннях очей (90, 54) та хвороби підшлункової залози тепер ясні. (93, 94), а також у зв'язку з ураженням карциноми при хронічній нирковій недостатності, ряд інших результатів досліджень демонструє роль переважання окислювальних радикалів у пошкодженні функції клітин (35). При цукровому діабеті та його пізніх ускладненнях результати досліджень на людях демонструють руйнівний баланс окисно-відновного гомеостазу (32, 219), загальне ослаблення антиоксидантної здатності тканин (наприклад, ендотелію судин) (137, 138), але найголовніше загальний антиоксидантний статус організму (31, 33, 64, 197, 171, 202, 205).

1.2. Антиоксиданти природного походження 1.2.1. Природний

вплив вмісту мікроелементів на розвиток антиоксидантної дії

концентрація суворо регламентована, тоді як метаболізм токсичних іонів важких металів погано регулюється, а їх кліренс також повільний (195). Накопичення важких металів у високих концентраціях пригнічує ферментну активність, впливає на вироблення гострофазних білків.

надаючи все більшого значення збереженню здоров'я, вони можуть принципово змінити наші харчові звички та спосіб життя,.

1.2.2. Raphanus sativus L. var. Niger Чорна редька (Raphanus sativus L. var. Niger) здавна була відомою їжею та травою. У народній медицині застосовується для лікування та профілактики здуття живота, повноти, неадекватного травлення, а також для запобігання утворенню жовчнокам’яної хвороби та збільшення вироблення жовчі. До його лікувальних сполук належать гірчичні глікозиди (ізотіоціанати), ефірні олії, ферменти, інгібітори ферментів, мікроелементи та вітаміни групи В і С (24, 91, 168). Він також містить значну кількість флавоноїдів та інших поліфенольних сполук, глюкозинолатів, з яких ізотіоціанати утворюються ферментом мірозиназою, що є агліконами глюкозинолатів. Деякі автори використовують глюкозинолати та їх похідні

також повідомляли про прямий антиоксидантний ефект ізотіоціанатів (222). Значний вміст флавоноїдів також може відігравати певну роль у загальному ефекті посилення здатності соку чорної редьки під час досліджень in vitro (128). Дослідження останніх десятиліть повідомляють про інгібуючу дію флавоноїдів на окислення ЛПНЩ, а також на агрегацію тромбоцитів. Численні дослідження in vitro демонструють антиоксидантні властивості флавоноїдів, які, як було доведено, є сильнішими за α-токоферол за певних експериментальних умов. У дослідженнях in vitro флавоноїди пригнічували окислення ЛПНЩ, викликане як клітинними, так і позаклітинними факторами. Кверцетин і рутин у високих концентраціях запобігали його виникненню через наявність окисленого ЛПНЩ

концентрація, безпосередньо захищає клітини від цитотоксичної дії окисленого ЛПНЩ (147, 148). Властивість антиоксиданта, що поглинає вільні радикали (28, 176, 177), характерна для сполук поліфенолу, що може бути підтверджено літературними даними, також може спостерігатися в тестовій системі in vitro.

1.2.3. Cichorium intybus (L.) 1.2.3.1. Поліфенольні сполуки: флавоноїди, похідні кавової кислоти Ще в 17 столітті цикорій або катанічна хвороба (Cichorium intybus L.) була корисною рослиною для лікування захворювань печінки та скарг жовчі, а також інфекцій сечовивідних шляхів. Цикорій також є важливим продуктом харчування, оскільки його бруньки можна їсти як соління, квіти та листя як салати. Смажений корінь Cichorium endivia відомий як замінник кави, оскільки вміст інуліну (поліфруктози) у корені карамелізується під час обсмажування, що призводить до характерного ароматного смаку кави (168). Крім того, до характерних компонентів рослини належать сесквітерпенові лактони як гіркі речовини, які сприяють травленню ефекту рослинних екстрактів. Hatano et al. Повідомляють про властивості поглиначів вільних радикалів флавоноїдних сполук, виявлених у коренях рослини цикорію в 1988 р. (83). Газзані та ін., Cichorium intybus var. Сильвестр вивчав свої антиоксидантні та прооксидантні компоненти in vitro та ex vivo, при цьому сполуки з антиоксидантними властивостями кожної фракції виявляли свій вплив як у хімічній, так і в біологічній системах. Екстракт рослини цикорію

його антиоксидантні властивості були продемонстровані in vitro за допомогою методу окислення β-каротин-ліноленова кислота, вираженого як% антиоксидантної активності (AA%). У подальших дослідженнях ex vivo продукти, що утворюються при окисленні ліпіпероксиду з використанням препарату мікросоми печінки, були визначені як 2-тіобарбітурова кислота як реакційноздатні сполуки. Низька молекулярна маса (МВ 0,05)

Значно різні значення позначаються різною кількістю символів *. (р. 10 років Різне число * вказує на значну різницю, с