перегрупування

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Темпол захищає мишей від ожиріння та резистентності до інсуліну
  • Темпол впливає на мікробіотики кишечника та активність BSH
  • Темпол збільшує кишкові тауринові жовчні кислоти
  • T-P-MCA інгібує сигнальний шлях FXR
  • Порушення кишково-специфічного FXR зменшує ожиріння
  • Tempol покращує ожиріння, інгібуючи кишкову ШКФ
  • обговорення
  • методи
  • Хімічні речовини та реактиви
  • Дослідження на тваринах
  • Препарат і посів первинних гепатоцитів
  • РНК-аналіз
  • Аналізи люциферази
  • Аналізи обміну речовин
  • Секвенування гена 16S рРНК кишкового мікробіома
  • Аналіз метагеномічних даних
  • Аналіз UPLC-ESI-QTOFMS
  • Обробка даних та багатовимірний аналіз даних
  • Діяльність BSH
  • Аналіз даних
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • мікробіом
  • Ожиріння
  • Терапевтичні засоби

реферат

Антиоксидант темпол зменшує ожиріння у мишей. Тут ми демонструємо, що темпол змінює мікробіом кишечника, переважно зменшуючи рід Lactobacillus та активність його гідролази жовчної солі (BSH), що призводить до накопичення кишкової тауро-β-муріхольної кислоти (T-P-MCA). T-P-MCA - антагоніст ядерних рецепторів рецептора фарнезоїду X (FXR), який бере участь у регуляції обміну жовчних кислот, ліпідів та глюкози. Його підвищений рівень під час лікування темполом інгібує FXR-сигналізацію в кишечнику. Fxr-нульові миші з високим вмістом жиру (Fxr AIE), які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, демонструють ожиріння, спричинене нижчим рівнем дієти, подібне до мишей дикого типу, оброблених тимчасово. Лікування Tempol додатково не зменшує збільшення ваги у мишей FxrAIE, що припускає, що FXR кишечника опосередковує вплив ожиріння tempol на ожиріння. Ці дослідження демонструють біохімічний зв’язок між мікробіомом, передачею сигналів ядерних рецепторів та порушенням обміну речовин, і припускають, що інгібування кишкової FXR може бути націлене препаратами проти ожиріння.

Ожиріння набуло глобальних масштабів епідемії і пов'язане з хронічними захворюваннями, такими як цукровий діабет 2 типу, серцево-судинні захворювання, гепатостеатоз та рак 1. Ожиріння розвивається в результаті споживання енергії, що перевищує витрати енергії, що призводить до чистого накопичення надлишкових калорій у вигляді жиру у жировій тканині 2. Ідеальний фармацевтичний підхід, який пригнічує апетит, блокує засвоєння жиру з дієти або сприяє мобілізації жиру 3. Повідомляється, що Темпол (4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперидин-1-оксил), антиоксидант та захист від радіації 4,5, запобігає ожирінню у мишей 6. Нещодавнє дослідження метаболоміки, засноване на мас-спектрометрії, показало, що темпол змінює рівні підозр на кишкові мікроби, що генеруються мікробами, даючи початкові вказівки на те, що темпол може або змінити склад мікробіомів, або змінити метаболічний потенціал кишкових бактерій 7. Цікаво, що темпол може також пригнічувати шкідливі наслідки ішемії/реперфузійної травми на тканини кишечника щурів, запобігаючи транслокації бактерій 8. Однак вплив темполу на мікробіом кишечника не вивчався.

Послідовність генів 16S рибосомної РНК (16S рРНК) генів кишкової мікробної популяції та метаболоміка на основі мас-спектрометрії є ефективними інструментами для характеристики мікробіому кишечника та метаболітів у біологічних матрицях відповідно. 9, 10. Відомо, що порушення балансу мікробіонів кишечника в кишечнику може впливати на різні метаболічні шляхи in vivo, такі як метаболізм жирних кислот і жовчних кислот 11. Це може сприяти виявленню того, що штам Firmicutes та штам Bacteroidetes, дві переважні популяції мікробіоти як у мишей, так і у людей, змінилися у мишей із ожирінням порівняно з худими тваринами 12. Вважалося, що шлюб 16S рРНК, секвенування, метагеноміка та метаболоміка можуть пролити світло на взаємодію між господарем та 100 трильйонами мікробів, що знаходяться в кишечнику 13. На сьогодні, однак, було проведено обмежені дослідження з використанням цих високопродуктивних підходів для виявлення потенційних цілей для лікування ожиріння та резистентності до інсуліну.

У цьому дослідженні комбінація секвенування генів 16S рРНК та метаболоміки на основі мас-спектрометрії була використана для вивчення змін мікробіому кишечника та метаболітів у моделі миші з високим вмістом жиру (HFD), обробленої темполом. Крім того, специфічні для кишечника миші Fxr-Null (Fxr AIE) використовувались для дослідження механізму, за допомогою якого мікробіом кишечника впливає на ожиріння та резистентність до інсуліну. Це дослідження демонструє, що темпол зменшує ожиріння та резистентність до інсуліну шляхом перебудови мікробіоти кишечника, що призводить до зміни складу жовчних кислот та пов'язаного з цим інгібування сигналізації рецептора фарнезоїду X (FXR).

результат

Темпол захищає мишей від ожиріння та резистентності до інсуліну

Темпол впливає на мікробіотики кишечника та активність BSH

( a ) Типові криві росту мишей, збережені на HFD. n = 5 мишей на групу. ( b ) відношення жиру до ваги жиру до нежирної ваги мишей після 6 тижнів HFD. n = 5 мишей на групу. c ) GTT і площа під 7-тижневою кривою HFD. n = 5 мишей на групу. d ) ITT 13 тижнів HFD. n = 5 мишей на групу. e ) Глюкоза натще, сироватковий інсулін натще і 14-тижневий індекс моделі гомеостазу HFD. n = 5 мишей на групу. Всі дані представлені як середнє значення ± sd, ANOVA, а потім двосторінковий t-тест Стьюдента. * P fl/fl .

Повнорозмірне зображення

Tempol покращує ожиріння, інгібуючи кишкову ШКФ

a ) Криві зростання мишей Fxr fl/Fl і тимчасових мишей Fxr AIE на HFD. n = 4-5 мишей на групу. b ) Склад тіла за допомогою ЯМР для відображення співвідношення маси жиру (ліворуч) та співвідношення жиру та худої (праворуч) у мишей, оброблених транспортним засобом та темполом, після 13 тижнів HFD. n = 4-5 мишей на групу. ( c ) GTT і площа під кривою після 5 тижнів мишей, оброблених тамплієрами на HFD. n = 4-5 мишей на групу. d ) ITT після 6 тижнів HFD. n = 4-5 мишей на групу. e ) Глюкоза натще, сироватковий інсулін натще та індекс оцінки моделі гомеостазу після лікування темполом на HFD протягом 16 тижнів. n = 5 мишей на групу. Всі дані представлені як середнє значення ± sd, ANOVA з подальшим одностороннім ANOVA з тестом Тукі. * Р 7. У моделі щурів з чудовою оклюзією брижової артерії лікування темполом запобігало шкідливим наслідкам ішемії/реперфузійної травми на тканини кишечника, зменшуючи транслокацію бактерій 8. Ці результати дають додаткові докази того, що темпол може впливати на мікробіом.

FXR відіграє ключову роль у метаболізмі жовчних кислот, ліпідів та глюкози. Миші Fxr -/- мали підвищену харчову непереносимість глюкози 33, а агоністи FXR покращували чутливість до інсуліну в генетичній моделі ожиріння 34. Однак інші дослідження припускають, що миші Fxr -/- покращили гомеостаз глюкози і що агоністи FXR посилювали порушення ліпідного обміну та резистентності до інсуліну у мишей із ожирінням 35, 36. Ці суперечливі докази ролі FXR у патогенезі метаболічних розладів можуть бути зумовлені передачею FXR в печінці, на відміну від цього дослідження, яке включає FXR кишечника. Крім того, відмінності в мікробіоти кишечника можуть пояснити вищезазначені експериментальні результати. Це дослідження пропонує докази, що підтверджують думку, що інгібування кишкової FXR як в моделі генетичної абляції мишей Fxr AIE, так і у мишей, які отримували темполь, покращує ожиріння, спричинене дієтою, та резистентність до інсуліну.

Хоча повний механізм, за допомогою якого кишкова сигналізація FXR впливає на ожиріння, до кінця не встановлений, ліпідоміка показала, що сироватка C14, C18, C18: 1, C20: 4 SM та відношення кераміду до S1P у Fxr AIE та мишей, оброблених темполом, є численними дослідженнями в останнє десятиліття підтримують роль РС та його метаболітів у патогенезі метаболічних розладів, пов'язаних із ожирінням 22. SM може метаболізуватися до кераміду, сфінгозину та S1P 37. Керамід активує протеїнкіназу С, N-кінцеву кіназу c-jun та інгібує передачу сигнального шляху інсуліну в периферичних тканинах-мішенях інсуліну, таких як печінка та жирова тканина 38. Повідомляється, що S1P протидіє дії кераміду. Показано, що підвищене співвідношення кераміду до SIP сприяє резистентності до інсуліну та ожирінню 39. Чи є це основним способом опосередкування впливу темполу та FXR на ожиріння, потрібно подальше дослідження.

Підводячи підсумок, метагеноміка та метаболоміка показали, що інгібування кишкової сигналізації FXR шляхом лікування темполом було пов’язане зі зниженням активності лактобактерій та його активності BSH. Накопичення T-P-MCA в кишечнику супроводжувалось інгібуванням FXR. Нещодавнє дослідження з використанням мишей без бактерій показало, що T-P-MCA може інгібувати передачу сигналів FXR in vivo в кишечнику 21. Це підтверджує дослідження in vitro, про які повідомляється тут. Висновок про те, що темпол покращує ожиріння шляхом інгібування кишкової сигналізації FXR, свідчить про те, що кишкова FXR може виступати потенційною клінічною мішенню при лікуванні ожиріння.

методи

Хімічні речовини та реактиви

Храм був придбаний у Сігми (Сент-Луїс, Міссурі). Жовчні кислоти замовляли у Steraloid, Inc. (Newport, RI) та Sigma та натрій TCA-d5 були від Toronto Research Chemicals Inc. (Торонто, Онтаріо). SM та кераміди отримували з полярних ліпідів Avanti. Набір S1P ELISA був придбаний у Echelon Biosciences Inc. (Солт-Лейк-Сіті, Юта). Набір жовчних кислот був придбаний у Catachem, Inc. (Оксфорд, Коннектикут). Усі розчинники та органічні реагенти були найвищого рівня.

Дослідження на тваринах

Препарат і посів первинних гепатоцитів

Гепатоцити отримували загальним методом перфузії 41. Первинні гепатоцити від 6-тижневих мишей C57BL/6N отримували шляхом перфузії колагенази 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клітини очищали центрифугуванням щільності 45% перколлу (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) та культивували в DMEM (Invitrogen) з 10% фетальної бичачої сироватки та 1% інсулін-трансферин-селен-етаноламіну (Invitrogen). Життєздатність гепатоцитів визначали, використовуючи виключення барвника трипанового синього, а також ті, у яких життєздатність перевищувала 85%. Середовище замінювали на DMEM з 1% фетальної бичачої сироватки після культивування протягом 4 год. Після голодування протягом 4 год клітини піддавали дії темполу/TCA/T-β-MCA/TCDCA/TUDCA/CDCA протягом 24 годин.

РНК-аналіз

Слизову оболонку кишечника обережно вишкрібали та швидко заморозили у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C до отримання РНК. РНК екстрагували із замороженої кишки за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen). Комплементарну ДНК синтезували з 1 мкг загальної РНК за допомогою зворотної транскриптази Superscript II (Invitrogen). Праймери qPCR були розроблені за допомогою qPrimerDepot, а послідовності показані в додатковій таблиці S1. qPCR проводили з використанням головної суміші ПЛР SYBR green у системі виявлення послідовностей ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Виміряні рівні мРНК були нормалізовані до рівнів 18S рибосомної РНК і виражались як кратна зміна щодо рівня контрольної групи.

Аналізи люциферази

Грейс Го (Університет Рутгерса) надала конструкцію люциферази світлячка PGL4-Shp-TK та експресійну плазміду Fxr людини. Пол А. Доусон (Медичний факультет Університету Вейка Фореста) надав експресійну плазміду Asbt людини. Плазміди трансфікували в клітини Caco2 (ATCC HTB-37) за допомогою реагенту для трансфекції ДНК X-tremeGENE HP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Клітини лізували і активність люциферази вимірювали за допомогою набору для аналізу подвійної люциферази (Promega, Madison, WI). Активність люциферази світлячка нормалізувалась до активності люциферази Renilla.

Аналізи обміну речовин

Для GTT мишам голодували протягом 16 год, відбирали кров і мишам вводили внутрішньочеревно 1 г кг -1 глюкози. Для ІТТ миші голодували протягом 4 год, відбирали кров, а потім внутрішньочеревно вводили інсулін (Елі Ліллі, штат Вашингтон, округ Колумбія) 1 U кг −1 маси тіла. Зразки крові відбирали з хвоста через 15, 30, 60 та 90 хв після ін'єкції, а глюкозу вимірювали за допомогою глюкометра (Bayer, Pittsburgh, PA). Інсулін натще у сироватці крові вимірювали за допомогою набору імуноферментних аналізів (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL).

Секвенування гена 16S рРНК кишкового мікробіома

Бактерії з вмістом калу та сліпої кишки витягували за допомогою набору для ізоляції ДНК PowerSoil (Mo Bio Laboratory, Inc., Карлсбад, Каліфорнія). Продукти ПЛР (

1000 п.н.) очищали за допомогою технології AgencourtAMPure (Бекман Коултер, Бреа, Каліфорнія), як описано в 454 Технічному бюлетені № 2011-002, Процедура видалення коротких фрагментів. Після очищення продукти кількісно визначали як Qubit (Lifetech, Карлсбад, Каліфорнія), так і qPCR, використовуючи набір кількісних оцінок бібліотеки KAPA Biosystems (KapaBiosystems, Woburn, MA). Продукти об'єднували на основі молярних кількостей, запускали на 1% агарозному гелі та екстрагували. Після очищення за допомогою набору для очищення ПЛР QIAquick (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія) якість та кількість оцінювали за допомогою чіпа DNA 7500LabChip на біоаналізаторі Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) та кількісному вимірі Qubit. Секвенування проводили з використанням чверті пластини Пікотітера на 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX + (Roche Diagnostics). qPCR проводили з використанням основного сумішу ПЛР SYBR green у системі виявлення послідовностей ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Умови ПЛР становили 50 ° С протягом 2 хв; 95 ° С протягом 10 хв; 40 циклів при 95 ° C протягом 15S; і 60 ° C протягом 1 хв.

Аналіз метагеномічних даних

Експериментальна установка складалася з 14 зразків, розподілених у вигляді 6 копій автомобіля та 8 копій датчика темпометра. Після якісної фільтрації та дедуплікації кожен зразок містить в середньому 11 000 зчитувань. Програмний пакет 42 mothur використовувався для попередньої обробки даних послідовності, а мультикласифікатор 43 проекту Ribosomal Database Project для присвоєння кожній послідовності таксономічному рангу. Попередня обробка полягала у фільтруванні зчитування для середньої якості 20, видаленні дубльованих послідовностей та розбитті на зразки за штрих-кодами, одночасно допускаючи одне невідповідність штрих-коду. Спеціальний статистичний інструмент, що використовує дисперсійний аналіз (ANOVA) з дизайном факторіальної обробки, виявляє таксономічні ранги, які показують статистично значущі зміни між вибірками. Щоб врахувати відмінності в загальній кількості прочитаних даних на вибірку, класифікації були перетворені у відсотки від загальної кількості прочитаних даних. Тоді такий підхід дозволив точне порівняння всередині та між групами.

Для виявлення бактерій, які суттєво змінилися в кількості, було введено аналіз ANOVA з розробленням факторіального лікування.

Повна модель називається моделлю фіксованих ефектів.

Процедури темпо і транспорт

Дослідження: дослідження 1, дослідження 2 (повторна послідовність дослідження 1)

Гіпотеза: бактерії не змінюються при різних дозах.

з i = 1, 2, 3; j = 1, 2; k = 1, 2, 3, 4

з i = 1, 2, 3; k = 1, 2, 3, 4

Повна модель розглядає ці два дослідження (дослідження 1 та дослідження 2) як блок, щоб спершу побачити, чи є ефект «дослідження». Якщо ефект «дослідження» є значним, то дослідження розглядаються окремо в задачі як блоковий ефект 42. Якщо ні, його видаляють та поєднують з даними двох досліджень 43. Нарешті, корекція Шидака була використана для корекції P-значення.

Аналіз UPLC-ESI-QTOFMS

Обробка даних та багатовимірний аналіз даних

Неопрацьовані дані вирівнювались за допомогою програмного забезпечення MarkerLynx (Waters Corp.), щоб сформувати матрицю даних, що складається з площ піків, що відповідають унікальному m/z та часу збереження без нормалізації. Аналіз метаболоміки, включаючи аналіз основних компонентів та моделі PLS-DA, проводили за допомогою SIMCA-P + 12 (Umetrics, Kinnelon, NJ) 44. Іони з кореляцією .80,8 до моделі суттєво сприяли розділенню між контрольною групою та групою, обробленою темполом.

Діяльність BSH

Калові білки готували із зразка калу (0,5 г) у рН 7,4 PBS (5,0 мл) з використанням ультразвукової обробки 45. Активність BSH вимірювали на основі утворення CDCA з TCDCA у фекаліях. Коротко кажучи, інкубацію проводили в 3 мМ ацетатному буфері, рН 5,2, що містив 0,1 мг мл -1 фекального білка і 50 мкМ TCDCA-d5 в кінцевому об'ємі 200 мкл. Після 20-хвилинної інкубації при 37 ° С реакцію зупиняли, занурюючи зразки в сухий лід. До 100 мкл реакційної суміші безпосередньо додавали сто мікролітрів метанолу. Після центрифугування при 14 000 × g протягом 20 хв 5 мкл супернатанту переносили у флакон з автоматичним пробовідбірником, який піддавали аналізу за допомогою системи UPLC у поєднанні з потрійним чотириполюсним тандемним мас-спектрометром XEVO (Waters Corp.).

Аналіз даних

Експериментальні значення представлені як середнє значення ± sd, статистичний аналіз проводили за допомогою двосторонніх t-критерію Стьюдента та одностороннього ANOVA з тестом Тукі та тестом Даннета, відповідно. Значення Р