Перевірка моделі харчування in vitro з використанням ентеральної формули в нейтрофілах

Листування: Доктор М. Фарріол.
Центр метаболічних досліджень та молекулярної біології (CIBBIM).
Загальна лікарня Vall d´´Hebron.
Passeig Vall d'Hebron, 119-129.
08035 Барселона. Іспанія.
Електронна адреса: [email protected]

Отримано: 21.09.2002.
Прийнято: 30-I-2003.

Вступ

Нейтрофіли швидко гинуть в пробірці і відчути морфологічні зміни, типові для клітин, які зазнають запрограмованої загибелі клітин 1. Культура нейтрофілів передбачає зниження їх життєздатності протягом годин, що робить їх чудовими «тестовими» частинками для досліджень старіння клітин. Визначити вплив харчування на зміни, спричинені старінням клітин, різних поживних елементів, таких як амінокислоти, вітаміни, фактори росту, ліпіди тощо. додаються до стандартних культуральних середовищ, як правило, як окремі добавки, і визначається їх біохімічна модуляція метаболічних шляхів 2 .

Неспецифічна реакція нейтрофілів на інфекцію є складною. Серед багатьох причетних факторів відомо, що компоненти клітинного середовища відіграють велику роль. Ліпідний склад середовища відіграє визнану роль у реакції запалення, хоча в цьому контексті немає єдиної думки щодо ступеня залучення або значення довжини або насиченості ланцюга жирних кислот 3. У дослідженнях на цю тему ліпіди додають у вигляді ізольованих добавок МСТ, ЛКТ або сумішей цих жирних кислот 4, 5. Однак на сьогоднішній день немає інформації про метаболічні зміни, що відбуваються в культурах нейтрофільних клітин після додавання комерційних ентеральних дієт з ліпідами та іншими поживними речовинами.

Метою цього дослідження є перевірка моделі культури клітин, що підходить для оцінки впливу стандартних харчових формул на функцію нейтрофілів. в пробірці. Зокрема, ми розробили модель застарілих клітин, в якій оцінюється повна комерційна формула, що містить виключно LCT як ліпідний компонент і часто застосовується у геріатричних пацієнтів.

Матеріал і методи

На попередньому етапі ми визначили оптимальну тривалість посіву та дозу дієтичної емульсії для цілей дослідження, дослідивши життєздатність клітин та морфологічні зміни. Після встановлення цих параметрів ми досліджували функціональність нейтрофілів, вимірюючи фагоцитоз, фрагментацію ДНК та ліпопероксидування. Всі експерименти проводились щонайменше тричі.

Культура нейтрофілів

Пул цільної крові збирали після нічного голодування у здорових добровольців віком від 18 до 55 років, а нейтрофіли відділяли від цільної крові за допомогою Polymorphrep TM (розчин натрію метризоат/декстран, d = 1,113) при 1/2 (об/об) центрифугуванням при 1750 об/хв протягом 30-35 хвилин при кімнатній температурі. Зразок промивали рівним об'ємом ClNa 0,45% і ще вдвічі більше рівними обсягами сольового розчину 0,9%. Червоні кров'яні клітини лізували, змішуючи гранулу в 10 мл холодного буфера для лізису (155 мМ NH 4 Cl; 10 мМ KHCO 3; 0,1 мМ ЕДТА; рН 7,4) протягом 10 хвилин. Нейтрофіли центрифугували, двічі промивали та висівали в культуральне середовище RPMI-1640 з L-глутаміном та FCS 10% без антибіотиків. Клітини з доданою дієтичною емульсією або без неї інкубували протягом 18, 42 або 76 годин при 37 ° C в атмосфері 5% CO 2.

Ми використовували повну стандартну ентеральну дієту (кубітанська; Nutricia Іспанія), що містить 3,5 г ліпідів на 100 мл, 14,2 г вуглеводів і 10 г білків. Склад ліпідів був таким: рослинна олія 97,1% (ріпак та соняшникова) та 2,9% молочного жиру, в результаті чого утворились 98,7% тригліцеридів з довгою ланцюгом (LCT) та 1,3% тригліцеридів із середньою ланцюгом (MCT). Молярність розраховували, припускаючи, що молекулярна маса LCT становила 865 дальтон, як описано 4. Концентрації ліпідів регулювали відповідно до протоколу та еквівалентні 0,04, 0,08, 0,2 та 0,4 мМ LCT. У деяких експериментах додавали лише вищі дози 0,2 і 0,4 мМ LCT.

Життєздатність клітин та морфологія

Клітини фарбували трипановим синім на 0,2% у сольовому розчині та підраховували за допомогою світлової мікроскопії. Додатково клітини фарбували May-GrГnwald/Giemsa і вивчали морфологію (х 100 світлової мікроскопії). Для визначення цитозольної пошкодження ферментативну активність лактодегідрогенази (ЛДГ) вимірювали в надосадовій рідині за допомогою автоматизованої техніки спектрометрії з використанням пірувату в якості субстрату та адаптували до приладу Hitachi 747.

Фагоцитоз

Для цього та всіх наступних визначень клітини спочатку центрифугували для отримання гранул. Кількісний тест NBT проводили на аликвотах по 250 мкл (2,5 х 10 5 клітин), змішаних з 20 мкл фосфатного буфера (PBS; pH 7,4), для нестимульованих зразків або з 20 мкл суспензії латексних гранул (діаметр частинок 1,094 мкм)., Sigma: LB-11) для стимульованих зразків. До всіх зразків додавали 250 мкл об'єму 0,1% нітроблю тетразолію (Sigma: N-6876), розведеного у фосфатному буфері (pH = 7,4). Через 30 хв інкубації при 37 ° С реакцію зупиняли, пробірки центрифугували при 3000 х g протягом 30 хв, супернатанти викидали і відновлений NBT екстрагували діоксаном (Sigma). Оптичну щільність (OD) вимірювали в супернатантах при 525 нм, використовуючи діоксан в якості холостого контролю, як описано 6 .

Біохімічні маркери

Активність LDH визначали у супернатанті (CV протягом 3,8%), а концентрації іонів Na +, K + та Cl - аналізували за допомогою іонно-селективних електродних автоматизованих методів (Hitachi 787).

Виробництво малонілдіальдегіду

Для вивільнення MDA як маркера ліпопероксидації ми використовували аликвоти 2 х 106 клітин і визначали кількість білка у зразку. Клітини лізували шляхом заморожування 3 рази на рідкому азоті та водяній бані при 37 ° С. Тіобарбітурову кислоту додавали при 0,375% у 15% TCA та 0,25N HCl і зразок кип'ятили протягом 15 хв. Потім його охолоджували на льоду і MDA екстрагували бутанолом. Зразок зчитували при 532 нм, і обчислення проводили з урахуванням молярного коефіцієнта екстинкції ε = 1,56 х 105, як описано 7, 8. Результати виражаються на міліграм білка (Пірс).

Реакція дифеніламіну

Олігонуклеосомні фрагменти ДНК, утворені при апоптозі, можна відокремити від не фрагментованої ДНК центрифугуванням. Це основа методики, модифікованої Віллі 9, яка дає кількісну оцінку відсотка фрагментованої ДНК у клітинній популяції. Апоптоз оцінювали в аликвотах 12 х 106 клітин. Коротко кажучи, клітинна гранула була ресуспендована буфером для лізису (10 мМ Трис, 20 мМ ЕДТА, 0,5% Тритон; рН 8,0) і після декількох етапів, включаючи гідроліз протягом 15 хв при 90 ° С, ми додали 240 мМ дифеніламіну в крижаному оцтовому кислоти та 0,01% (об./об.) паральдегіду. Зразки інкубували при температурі 30 ° С протягом ночі та вимірювали поглинання (595 нм) зі стандартної кривої (натрієва сіль ДНК тимусу теляти; Sigma D-1501).

Для аналізу даних використовували дисперсійний аналіз та тест Вілкоксона (SPSS, 8.0). Значимість була встановлена ​​на рівні р 10 .

Зростання фрагментації ДНК у культурах з вищою концентрацією LCT вказувало на збільшення апоптозу клітин (таблиця III).

Щодо вироблення MDA як показника ліпопероксидації, культури клітин з 0,2 та 0,4 мМ доданого LCT продемонстрували значне зниження, яке було більшим при вищій дозі (таблиця III).

Культура нейтрофілів дозволяє вивчати біохімічні механізми та фармакологічні та харчові ефекти, пов’язані з імунологічною реакцією. Це дослідження підтверджує в пробірці модель, призначена для дослідження впливу стандартної харчової формули (що містить ліпіди LCT) на функціонування нейтрофілів. Після тестування кількох періодів культури максимальний час культивування встановлювали о 18 годині, час, після якого життєздатність клітин починає знижуватися 11. Значне збільшення спонтанного апоптозу спостерігається через 20 годин культури 12. За погодженням із попередніми спостереженнями, відсутність цитозольного пошкодження через 18 годин було підтверджено тим фактом, що позаклітинний рівень LDH, цитозольний маркер, що використовується в численних клітинних моделях, не мав змін на даний момент .

Аналіз іонів виявив значне збільшення позаклітинного калію без змін концентрацій натрію. Було описано, що внутрішньоклітинне співвідношення калію/натрію є показником життєвої сили клітин 10. Виведення калію в середовище із підтриманням концентрації натрію знизило б цей коефіцієнт, що можна трактувати як ознаку зниження життєвого тонусу клітин, відповідно до старечого статусу клітин.

По-людськи в пробірці клітинні дослідження, що перевіряють імуномодулюючі властивості ліпідів, різні ліпідні емульсії додають до клітинних культур як добавки. Використовувані типи (LCT, MCT, LCT/MCT або структуровані) та кількості значно різняться: від 1,25 до 5,0 ммоль/л 14, від 0,00188 до 0,03% 5 (за нашими розрахунками, еквівалент 0,075 до 1,2 мМ), 2,5 мМ тригліцеридів на літр 15 тощо. У цьому дослідженні надані ліпіди були LCT, присутніми в комерційній ентеральній дієті. Концентрацію ентеральної дієти в аналізах було важко встановити, оскільки література не містить інформації про використання повноцінних дієт в пробірці. Ми вибрали дози від 0,2 до 0,4 мМ, що еквівалентно приблизно 1/3 концентрації, використаної Kruimel 14. Засновуючи свою оцінку на даних пацієнтів, які отримували TPN 16, вважав Круймель в пробірці концентрації 1,25 ммоль/л мають бути фізіологічними. У попередніх експериментах (дані не наведені) ми перевірили цю концентрацію в культурі і виявили, що вона надмірно висока, що виключає визначення LDH. Таким чином, ми визначилися з меншою концентрацією.

Фагоцитозна здатність культивованих нейтрофілів продемонструвала незначне зниження при додаванні різних кількостей ЛКТ-вмісної дієти. Цей висновок відповідає опублікованим результатам, коли додавання сумішей MCT або MCT/LCT викликало помітне інгібування фагоцитозу, але лише LCT привів до більш помірного зниження 15 .

Метод дифеніламіну, що відокремлює олігонуклеосомні фрагменти ДНК, утворені під час апоптозу, від не фрагментованої ДНК, дає показник відсотка фрагментованої ДНК у популяції клітин. Ця методика не визначає точного підрахунку апоптотичних клітин, але в поєднанні з контролем дає надійний показник величини загибелі клітин, що відбувається в культурах. Результати цього аналізу показали, що за 18 годин інкубації без додавання дієти 10% фрагментація клітин відбулася спонтанно. З додаванням 1% кубітану (об./Об.), Що еквівалентно 0,4 мМ LCT, відсоток фрагментації (часто вважається біохімічною ознакою апоптозу) подвоївся, але також було зареєстровано дуже значне зменшення ліпопероксидації; таким чином ми зіткнулися з двома очевидно суперечливими висновками. Проте нещодавнє дослідження запропонувало відокремити фрагментацію ДНК від інших показників апоптозу нейтрофілів, що може пояснити цю очевидну розбіжність. Автори стверджують, що вимірювання фрагментації ДНК одне не є хорошим методом для оцінки змін, викликаних індукторами апоптозу, такими як донори оксиду азоту 17 .

Парадоксально, але спостерігалося зниження рівня окиснення ліпопероксидації з додаванням дієти з більшою концентрацією. Пояснення цих результатів непевне, але ми вважаємо, що це може бути пов’язано з наявністю більшої кількості антиоксидантів у ентеральній дієті (вітаміни, селен, таурин тощо), які мали б захисний ефект проти окисного стресу, що утворюється під час 18 годин нейтрофільного старіння.

На закінчення, це перше дослідження, в якому повноцінна комерційна ентеральна дієта безпосередньо додається до культур, щоб дослідити зміни у функції клітин. Результати фагоцитозу, фрагментації ДНК та ліпопероксидації, отримані з 0,4 мМ LCT, надані як в пробірці Ентеральна дієта вказує на те, що ця модель нейтрофілів адекватно повідомляє про зміни функціональної здатності нейтрофілів, що відбуваються під час старіння клітин в результаті модуляції харчування. Встановлені умови культури не надто вимогливі, що робить цю систему відносно простою у виконанні та потенційно застосовною до різних вікових груп та патологічних станів.

Подяка

Ми дякуємо пані Селін Кавалло за поради з англійської мови.

1. Colotta F, Re F, Polentarutti N, Sozzani S та Mantovani S: Модуляція виживання гранулоцитів та запрограмована загибель клітин цитокінами та продуктами бактерій. Кров, 1992, 80: 2012-2020. [Посилання]

2. Hiroi M, Tajima M, Shimojima T, Kashimata M, Miyata T and Sakagami H: Anticancer Res, 1998, 18: 1813-1818. [Посилання]

3. Bellinati-Pires R, Waitzberg DL, Salgado MM і Carneiro-Sampaio MM: Функціональні зміни нейтрофілів людини за допомогою тригліцеридних емульсій із середнім ланцюгом: оцінка фагоцитозу, знищення бактерій та окисної активності. J Leukoc Biol, 1993, 53: 404-410. [Посилання]

4. Wanten GJA, Roos D та Naber AHJ: Вплив структурно різної ліпідної емульсії на міграцію нейтрофілів людини. Клін Нутр, 2000, 19: 327-331. [Посилання]

5. Granato D, Blum S, Rössle C, Le Boucher J, Malnoe A і Dutot G: Вплив парентеральних ліпідних емульсій з різним складом жирних кислот на функції імунних клітин in vitro. JPEN, 2000, 24: 113-118. [Посилання]

6. De la Fuente M, Del RÃo M, FernÃndez D і HernÃnz A: Модуляція фагоцитарної функції у мишачих перитонеальних макрофагах бомбезином, вивільняючим гастрин пептидом і нейромедином C. Імунологія, 1991, 73: 205-211 [Посилання]

7. Акції J та Dormandy TL: Самоокиснення ліпідів червоних клітин людини, індукованих перекисом водню. Br J Haematol, 1971, 20: 95-111. [Посилання]

8. Virgili N, Farriol M, Castellanos JM, GirГі M, Podzamczer D та Pita AM: Оцінка імунних маркерів у пацієнтів із безсимптомним СНІДом, які отримують добавки до риб’ячого жиру. Клін Нутр, 1997, 16: 257-261. [Посилання]

9. Wyllie AH, Kerr JF and Currie AR: Клітинна смерть: значення апоптозу. Int Rev Cytol, 1980, 68: 251-306. [Посилання]

10. Nkamgueu EM, Adnett JJ, Bernard J, Zierold K, Kilian L, Jallot E, Benhayoune H та Bonhomme P: In vitro ефекти частинок цирконію та глинозему на макрофаги, отримані з моноцитів крові людини; Рентгенівський мікроаналіз та проточні цитометричні дослідження. J Biomed Mat Res, 2000, 52: 587-594. [Посилання]

11. Curi TCP, Demelo MP, Palanch AC, Miyasaka CK і Curi R: Відсоток фагоцитозу, вироблення O-2 (із центральною крапкою) H2 O2 і NO та антиоксидантна ферментна активність нейтрофілів щурів у культурі. Cell Biochem Funct, 1998, 16: 43-49. [Посилання]

12. Majewksa E, Sulowska Z та Baj Z: Спонтанний апоптоз нейтрофілів у цільній крові та його відношення до білків гена апоптозу. Scand J Immunol, 2000, 52: 496-501. [Посилання]

13. Модрянський М., Улрічова Дж., Бахледа П., Анценбахер П., Анзенбачерова Е., Вальтерова Д. та Сіманек В. Гепатоцити людини - модель токсикологічних досліджень. Функціональна та біохімічна характеристика. Gen Physiol Biophys, 2000, 19: 223-235. [Посилання]

14. Kruimel JW, Naber AH, Curfs JH, Wenker MA і Jansen JB: При тригліцеридах із середньою ланцюгом відбувається вища і швидша продукція радикалів кисню за рахунок стимульованих поліморфно-ядерних лейкоцитів. JPEN, 2000, 24: 107-112. [Посилання]

15. Wanten GJA, Geijtenbeek TBH, Raymakers RAP et al.: Ліпідні емульсії, що містять тригліцериди із середнім ланцюгом, збільшують нейтрофіли людини (2 експресія інтегрину, адгезія та дегрануляція. JPEN, 2000, 24: 228-233. [Посилання]

16. Ball MJ: Парентеральне харчування у важкохворих: використання тригліцеридної емульсії із середнім ланцюгом. Med Intensive Care Med, 1993, 19: 89-95. [Посилання]

17. Тейлор Е.Л., Мегсон Іл., Хаслетт С та Россі А.: Дисоціація фрагментації ДНК від інших ознак апоптозу нейтрофілів, оброблених оксидом азоту: відмінності між окремими препаратами-донорами оксиду азоту. Biochem Biophys Res Com, 2001, 289: 1229-1236. [Посилання]

В Весь вміст цього журналу, крім випадків, коли він ідентифікований, перебуває під ліцензією Creative Commons

• Психологія логопедичне дієтичне харчування
• Валерія Дегенаро зізналася у своїй дієті. Вони вважають, що для того, щоб бути моделлю, як салат - Diario Panorama
• Національні опитування щодо харчування - Великобританія Національні опитування щодо дієти та харчування - Новини
• Наукові праці - · 1 IX чилійський конгрес клінічного харчування, ожиріння та метаболізму - PDF
• Перевірка анкети емоційних пожирачів (CCE) у Чилі