Резюме
Кріоелектронні мікроскопи, скануючі (SEM) або пропускаючі (TEM), широко використовуються для характеристики біологічних зразків або інших матеріалів з високим вмістом води 1. SEM/сфокусований іонний пучок (FIB) використовується для виявлення цікавих характеристик у зразках та витягніть тонку прозору електронну фольгу для перенесення в кріо-ТЕМ.
Анотація
Вступ
FIB широко використовується для підготовки зразків ПЕМ завдяки багатьом його перевагам 7. Назвемо лише декілька: використання високоенергетичних іонів з майже нормальним падінням мінімізує вплив диференціальних швидкостей помелу, пов’язаних з матеріалом; область, яка відбирається з об'ємного зразка, може бути обрана з точністю менше мікрона; видаляється дуже мала кількість матеріалу. Деякі останні технічні досягнення дозволили використовувати FIB також для підготовки зразків ТЕМ при 2,8-10 кріогенних температурах. Є кілька переваг перед традиційним методом підготовки кріомікротомії 11,12, що застосовується переважно для зразків м’якої речовини, таких як відсутність механічної деформації нарізаного аркуша, відсутність слідів ножем та можливість приготування композиційних зразків. жорсткі/м'які інтерфейси або компоненти.
Протокол
Примітка: Усі параметри, зазначені в цьому протоколі, є дійсними для зазначених тут приладів та моделей. Деякі з цих параметрів (позначені * в тексті) можуть відрізнятися, якщо ви використовуєте іншого виробника або модель.
1. Впровадження FIB/SEM
2. Заморожування зразка
3. Іон подрібнення
4. Кріо-передача в TEM
Репрезентативні результати
У цій роботі були використані: подвійний промінь FIB/SEM, оснащений наноманіпулятором та кріогенною камерою; TEM з підтримкою кріопереносу; станція передачі кріо-прототипів. Гатаном були модифіковані лопаті антиконтамінатора (АС) камери кріопідготовки та наконечник наноманіпулятора (НМ). У порівнянні зі стандартною кріокамерою, штирі змінного струму більші, щоб забезпечити більший тепловідвід для наконечника НМ. Крім того, кондиціонер оснащений затискачами для з'єднання Cu-оплеток для теплообміну з наконечником NM. Шини FIB/SEM були модифіковані, щоб дозволити NM знаходитись і знаходитися всередині, навіть коли вентиляційна камера провітрювалася. Слід зазначити, що параметри, використані в цій роботі, є найбільш відповідними для обладнання, згаданого вище; Ці параметри можуть знадобитися для коригування під час роботи з іншими типами обладнання. Для роботи з цим протоколом слід дотримуватися звичайних запобіжних заходів щодо роботи з кріогенними, азотними та рідкими вакуумними системами.
Фігура 1. Кріо-SEM зображення спор A. niger до осадження Pt.
Малюнок 2. Та сама ділянка на малюнку 1 після осадження Pt, але до затвердіння.
Малюнок 3. Кріо-SEM зображення тієї ж області на малюнку 2, нахилене 52 °, після осадження та затвердіння Pt, із виконуваним фрезеруванням траншеї (див. Крок 3.7).
Малюнок 4. Лезо, готове до виймання.
Малюнок 5. Холодний наконечник наноманіпулятора контактує з фольгою.
Малюнок 6. Друге кріоосадження Pt використовується для зварювання наноманіпулятора та фольги між собою.
Малюнок 7. Холодний наноманіпулятор використовується для перенесення фольги в зону фіксації сітки ТЕМ.
Малюнок 8. Кріоосадження використовується ще раз для фіксації фольги до сітки ТЕМ.
Малюнок 9. Фольга відрізана від наноманіпулятора і тепер готова до зберігання електронів або розрідження прозорості.
Малюнок 10. Проміжний етап проріджування, у перерізі видно кілька суперечок.
Малюнок 11 Кріо-SEM зображення зразка після остаточного розрідження; більшість інших спор мали тенденцію до подрібнення, оскільки фольга почала скручуватися.
Малюнок 12. Складене зображення аркуша Cryo-TEM. Частина каблука була включена в ламелі (чорна стрілка).
Обговорення
Через природу кріоосадження (етапи 3.5, 3.10 та 3.13) значна частина зразка буде покрита, що перешкоджає огляду вихідної поверхні. Це може ускладнити відстеження рентабельності інвестицій, якщо не використовується кілька торгових марок, як запропоновано на кроці 3.3.
Під час кроків 4.5 та 4.7 ризик потрапляння тонких плівок у повітря. Цього слід уникати, оскільки це може призвести до того, що волога в повітрі утворює крижані кристали на поверхні зразка, можливо, аж до затемнення важливих характеристик. Ці дії слід виконувати якомога швидше, але в той же час це може призвести до втрати зразка внаслідок неправильного поводження під час передачі сейо. Користувачеві рекомендується відпрацювати ці кроки, використовуючи порожні сітки TEM, перш ніж здійснювати спробу фактичного зразка.
У галузі матеріалознавства інструмент FIB став провідним методом підготовки зразків ТЕМ протягом десятиліття після його комерціалізації. Оскільки його можна використовувати практично на будь-якому зразку, це позбавляє потреби адаптувати техніку підготовки до типу зразка. Ми твердо впевнені, що те саме може статися при кріогенних температурах завдяки процедурі, детально описаній тут. Його застосування до більших зразків все ще залежить від здатності кріоконсервувати у склоподібному стані, але такі методи, як заморожування за зануренням або заморожування під високим тиском 3,5, можуть виявитись оптимальним рішенням цієї проблеми.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Це дослідження отримало підтримку від проекту QNano http://www.qnano-ri.eu, який фінансується дослідницькими інфраструктурами Європейського Співтовариства в рамках Програми спроможностей FP7 (грант № INFRA-2010 до 262 163).
Ми також дякуємо дослідницькій раді Форми фінансової підтримки.