Процедури отримання ліпідів-носіїв як системи вивільнення банківських харчових інгредієнтів

  • Автори:Даніель Тенлладо ван Дер Рейден
  • Директори дисертацій:Карлос Торрес Оліварес (реж. Тес.), Гільєрмо Реглеро Рада (кодиров. Тес.)
  • Читання: В Мадридському автономному університеті (Іспанія) у 2013 році
  • Ідіома: Іспанська
  • Кваліфікаційний суд дисертації:Тіціана Форнарі (голова), Луїс Васкес де Фрутос (секрет), Ана Рамірес де Моліна (речник), Е. Ібаньєс Езекієль (речник), Роза Марія Бланко Мартін (речник)
  • Повний текст недоступний (Дізнайтеся більше.)
  • Резюме

    Синтез структурованого ліпіду або ліпідного транспорту речовини, що представляє біологічний інтерес, повинен покладатися на різні технології. Ці технології повинні бути промислово масштабованими, дешевими та чистими як для навколишнього середовища, так і для отримання кінцевого продукту без домішок.

    ліпідів-носіїв

    Під час процесу синтезу необхідно постійно знати склад зразків, з якими працює, для яких група, в якій працював докторант, опублікувала методи аналізу [1] і з якими вони працюють регулярно.

    Для того, щоб мати новий інструмент аналізу та зробити кількісну оцінку зразків більш надійною, було проведено розробку нового методу газової хроматографії. Метою було розділити зразок на хроматографі за класами ліпідів і мати можливість кількісно визначити їх без необхідності проводити попередню підготовку зразка, для чого було безпосередньо введено колонку. Для кількісної оцінки введених зразків у якості внутрішніх стандартів використовували додекан та гексадекан. Коефіцієнт відповіді був отриманий для кожного з досліджуваних аналітів за допомогою п'яти послідовних ін'єкцій чистих стандартів у відомих концентраціях [2]. У всіх випадках роздільна здатність різних піків була більшою за 3,5, що свідчить про повне розділення всіх досліджуваних компонентів.

    Ферментативний біокаталіз виявився ефективним, селективним та чистим інструментом як для синтезу, так і для каталізу ліпідів. Застосування ферментів на певній промисловій стадії означає високу вартість процесу, тому повторне використання біокаталізатора є важливим. У свою чергу, повторне використання ферменту повинно здійснюватися таким чином, щоб отриманий продукт завжди був однаковим, незалежно від циклу повторного використання тієї ж партії біокаталізатора. Для цього необхідно змоделювати кінетику ферментативної реакції, розглядаючи дезактивацію ферменту як один із ключових параметрів.

    Після різноманітних випробувань із використанням різних ферментів у безлічі реакційних умов було вирішено працювати з ліпазою Pseudomona cepacia (нещодавно перекваліфікованою як Burkhoderia cepacia) в реакціях алкоголізу, оскільки це призвело до високої конверсії тригліцеридів (90%) у скорочені рази. і його повторне використання було здійсненним, оскільки його дезактивація в реакціях алкоголізу була дуже низькою. Для роботи з цією ліпазою був розроблений метод іммобілізації, який дозволяв відновлювати фермент після кожного реакційного циклу.

    Видно, як концентрації FAEE, присутні в реакційній суміші, змінювались протягом 2-го, 5-го, 10-го та 15-го циклів. Концентрація FAEE за 6 годин реакції у 2-му, 5-му, 10-му та 15-му циклах становила 1104,3, 897,7, 613,9 та 441,8 мМ відповідно. Ці результати показали, що інактивація ліпази мала значний вплив на продукцію FAEE. Якби дезактивація була незначною, подібні рівні FAEE були б отримані протягом чотирьох досліджуваних циклів. Щоб описати втрату ферментної активності з часом, у кінетичну модель було включено термін дезактивації. Для поліпшення якості припасування використовували математичний вираз для опису ферментативної дезактивації, яка розглядала незворотний механізм дезактивації, що паралельно супроводжується незворотною перебудовою ліпази, що утворює стабільну активну форму. Значення, отримані за допомогою цієї моделі дезактивації ферментів, забезпечували хороше узгодження значень, отриманих з експериментальними даними.

    Цей результат показав, що найбільш вірогідний механізм дезактивації ліпази слідував двом паралельним процесам, що приводили до стабільної та активної форми ліпази та неактивної форми. Завдяки цьому дана модель дезактивації була використана для прогнозування часу реакції для оптимального повторного використання біокаталізатора. Включення цього терміну дезактивації ферменту дозволило використовувати концепцію часу псевдореакції, яка перетворює час реакції кожного циклу у відповідні їм нові значення, тобто ті, які були б отримані, якби фермент не був частково деактивовано.

    Концепція часу псевдореакції відповідає інактивації ліпази і дозволяє коригувати кінетичні дані різних реакцій, що проводяться з однією і тією ж партією ліпази, але з різним ступенем дезактивації. Важливим застосуванням цієї концепції була можливість передбачити, як довго реакційна суміш повинна залишатися в контакті з ліпазою, щоб досягти певного ступеня алкоголізму, залежно від ступеня дезактивації використовуваної ліпази.

    Перший прогноз було зроблено з тією ж партією ліпази, що використовувалася в попередніх 15 тестах. Ця партія відповідала іммобілізованій ліпазі, яка працювала в реакціях алкоголізу протягом 90 годин. Метою залишалося досягнення 90% конверсії TAG, що призвело до концентрації FAEE 933,7 мМ, яку встановили як цільову. Цю концентрацію потрібно було досягти без урахування залишкової активності використовуваної ліпази. Згідно із запропонованою моделлю дезактивації, час псевдореакції, спричинений цією концентрацією FAEE, становив t * = 2772 год. Нарешті, використовуючи рівняння, отримане з кінетичною моделлю, можна було передбачити час, необхідний для тривалості 16-го циклу, щоб отримати цільову молярну концентрацію FAEE. Цей час реакції виявився 19,7 год. 16-й цикл алкоголізу проводили експериментально протягом 19,7 год, отримуючи концентрацію FAEE 876,0 мМ. Цей результат виявив розумну відповідність між експериментальною конверсією та прогнозованою кінетичною моделлю.

    Як приклад транспортування ліпідів речовини, що представляє біологічний та промисловий інтерес, було проведено дослідження етерифікації тирозолу олеїновою жирною кислотою. Це дослідження було зосереджено на знанні впливу різних змінних, які втручались у процес. Реакцію проводили в еквімолярних умовах і в реакційному середовищі, що не містить розчинників. Вивчали вплив розміру частинок тирозолу, температури, концентрації біокаталізатора та зниженого тиску. Крім того, були проведені дослідження повторного використання біокаталізатора, а також антиоксидантна активність за допомогою тесту ранцимата. Всі ці дослідження були проведені порівнянням ліпази Candida antarctica, іммобілізованої в актилокремнієвих агломератах, та ліпази Candida antarctica, іммобілізованої Новозимом (435).

    Слід зазначити, що тирозол не розчиняється в олеїновій кислоті в тестованих умовах реакції, і що можливим обмеженням швидкості реакції є швидкість розчинення тирозолу в реакційному середовищі. Раніше вже було описано, що чим менший розмір частинок реагентів, тим швидша швидкість реакції [4]. Обмеження масообміну, пов'язані зі швидкістю розчинення тирозолу в реакційній суміші, вивчали з використанням комерційного тирозолу та просіяного тирозолу з розміром частинок менше 0,1 мм. Більш висока швидкість реакції була досягнута за допомогою тирозолу з розміром частинок менше 0,1 мм. Слід зазначити, що за короткий час реакції (60 і 90 хвилин) із застосуванням просіяного тирозолу швидкість реакції була приблизно в 3 і 2 рази швидшою, ніж із вихідним тирозолем. Однак подібне остаточне перетворення було отримано у двох досліджуваних випадках. У подальших експериментах як реакційний субстрат використовували просіяний тирозол.

    Розчинність тирозолу в реакційній суміші оцінювали, для чого проводили два різні тести. Спочатку розчинність тирозолу в олеїновій кислоті порівнювали при 40, 50 та 60 ° С. Також була визначена розчинність тирозолу в олеаті тирозолу при 50 ° C. Отримані результати свідчать про дуже низьку розчинність тирозолу в олеїновій кислоті, проте розчинність тирозолу в олеаті тирозолу була в 4 рази вищою. Ці результати показали, що олеат тирозолу, що утворюється в реакції етерифікації, покращує розчинність тирозолу в реакційній суміші, так що він може позитивно сприяти швидкості реакції етерифікації.

    Ферментативну етерифікацію тирозолу олеїновою кислотою вивчали при трьох різних температурах (40, 50 і 60 ° C) за допомогою обох ферментів. Як і очікувалось, чим вище температура, тим вище спостерігається швидкість етерифікації. Реакція рівноваги була досягнута, коли олеат тирозолу досяг концентрації 73% мас./Мас. При 40 ° C, 76% мас./Мас. При 50 ° C і 79% мас./Мас. При 60 ° C. У всіх досліджуваних випадках швидкість етерифікації була швидшою у присутності Новозиму 435, ніж у присутності октилкремнієвих агломератів ліпази Candida antarctica. Менша активність іммобілізованої ліпази в агломератах порівняно з комерційною, ймовірно, була зумовлена ​​меншим навантаженням ліпази Candida antarctica в агломератах. Для того, щоб максимально зберегти активність ліпази та мінімізувати випаровування та деградацію тирозолу, відтепер експерименти проводили при 50 ° C.

    Зменшення відсотка іммобілізованої ліпази, що додається до реакційної суміші, має головну перевагу зменшення витрат на біопроцес, крім зменшення кількості твердого матеріалу в реакційній суміші, що особливо актуально, коли відсоток речовини твердого речовини в реакційній суміші дуже високо, слід враховувати, що на початку реакції тирозол становить приблизно 33% реакційної суміші. Порівнювали два різні відсотки іммобілізованої ліпази в ферментативному синтезі олеату тирозолу, 5% та 10% мас. Зменшення кількості біокаталізатора призвело до значного зменшення швидкості реакції з двома іммобілізованими ліпазами, тому в подальших експериментах використовували 10% від маси біокаталізатора.

    Всі реакції етерифікації, проведені при атмосферному тиску, приводили до суміші продуктів, що складається з олеату тирозолу та різних кількостей непрореагованої олеїнової кислоти та тирозолу. Для того, щоб зрушити рівновагу реакції у бік утворення олеату тирозолу, воду, що утворилася під час реакції етерифікації, довелося видалити.

    Для досягнення цієї мети можуть бути використані різні стратегії, такі як розрідження азоту, використання осушувача або реакція при зниженому тиску. Проводячи реакцію у вакуумі (200 мбар), суміш продуктів, що складається з понад 85% олеату тирозолу, була отримана менш ніж за 3 години, як з Новозимом 435, так і з ліпазою Candida antárctica, іммобілізованою в октилових агломератах. . Однак для повного видалення води з реакційної суміші потрібен був більший вакуум. Тому для досягнення конверсії олеїнової кислоти та тирозолу вище 85% використовували вакуум 10 мбар.

    За цих умов отримували суміш продуктів, що складається з понад 95% олеату тирозолу, за 2 години для Новозиму 435 та за 3 години для ліпази з Candida antarctica, іммобілізованої в агломератах. Різний вміст води в двох іммобілізованих ферментах (1,77% для Новозиму 435 та 2,17% для агломерата октил-діоксиду кремнію) також може відігравати важливу роль у швидкості реакції, що спостерігається.

    Іншим важливим аспектом, який слід врахувати, була часткова летючість тирозолу. Інші автори [5] спостерігали, що надмірний вакуум і температура можуть призвести до часткової перегонки тирозолу. Для оцінки часткового випаровування тирозолу реакційну суміш, подібну до описаної вище, але без додавання ферменту, поміщали у вакуум (10 мкм) на 8 годин. Після цього проаналізували аликвотну частину суміші і порівняли вміст тирозолу із вмістом вихідної суміші. В аналізованих зразках спостерігався однаковий відсоток тирозолу, що свідчить про те, що в експериментальних умовах випаровування випаровування тирозолу незначне.

    Видалення води з реакційної суміші може мати два протилежні ефекти: 1) зміщення рівноваги реакції у бік утворення олеату тирозолу та 2) дегідратація іммобілізованої ліпази, що впливає на залишкову активність біокаталізаторів. Як уже зазначалося, повторне використання ліпази є ключовим фактором у застосованому біокаталізі. Тому повинен бути досягнутий баланс між швидкістю реакції та стабільністю ферменту.

    Для того, щоб перевірити залишкову активність ліпази після реакції етерифікації, було проведено три послідовних випробування з однаковою партією для обох ліпаз.

    Тести 2 та 3 для ферментативного синтезу олеату тирозолу (обидва вони проводили з просоченою ліпазою, виділеною з реакційної суміші першого тесту) розвивали подібну швидкість реакції, вказуючи на те, що інактивацію двох ферментних іммобілізатів можна вважати незначною. Також можна помітити, що для двох досліджуваних знерухомлених досліджень випробування 2 і 3 були повільнішими, ніж перше випробування. Це можна пояснити підвищеними обмеженнями дифузії реагентів, коли ліпазу попередньо занурювали в реакційну суміш.

    За таких умов реакції можна було отримати суміш продуктів, що складається з понад 95% олеату тирозолу, за 2 години з Новозимом 435 і за 5 годин з агломератами октил-діоксиду кремнію. Хоча стабільність обох каталізаторів була однаковою, швидкість реакції, досягнута з октилкремнієвими агломератами, була нижчою, ніж з Нововозимом 435. Оптимізація іммобілізованих за допомогою октилкремнієвих агломератів для отримання більш активного біокаталізатора та/або з більшим навантаженням ферментів на грам підтримки, це необхідно.

    Для порівняння обох біокаталізаторів для етерифікації тирозолу олеїновою кислотою це було проведено з використанням однакових одиниць активності (1687 АЕ) Новозиму 435 та іммобілізованої ліпази Candida antarctica в октилових агломератах. -Силіка. Результати показали, що швидкість реакції була однаковою з двома досліджуваними ліпазами. Отже, він дійшов висновку, що різниця в швидкості реакції не була зумовлена ​​збільшенням масообміну або обмеженнями дифузії через агломерати октил-діоксиду кремнію, і, отже, можна стверджувати, що різниця в швидкості реакції, що спостерігається в попередні експерименти були виключно пов'язані з більшою кількістю міліграмів ферменту на грам носія в Новозимі 435, порівняно з ліпазою Candida antarctica, іммобілізованою в агломератах октил-діоксиду кремнію. З цієї причини зручно проводити нові дослідження з метою покращення вантажопідйомності нової опори, завдяки чому можна включати більшу кількість ферменту на грам біокаталізатора.

    Крім того, різний порядок отримання ефірів тирозолу може призвести до різної кінцевої антиоксидантної активності отриманих сполук.

    Реакції, що спостерігались у попередніх експериментах, були виключно пов'язані з більшою кількістю міліграмів ферменту на грам носія в Новозимі 435, порівняно з реакцією ліпази Candida antarctica, іммобілізованої в актилокремнієвих агломератах. З цієї причини зручно проводити нові дослідження з метою покращення вантажопідйомності нової опори, завдяки чому можна включати більшу кількість ферменту на грам біокаталізатора.

    Крім того, різний порядок отримання ефірів тирозолу може призвести до різної кінцевої антиоксидантної активності отриманих сполук.