предметів

реферат

У жінок статеві клітини містяться в структурах яєчників, які називаються первинними фолікулами. Кількість первинних фолікулів у заповіднику яєчників є найважливішим фактором, що визначає фертильність. Незважаючи на це значення, бракує знань про точні фізіологічні механізми, що регулюють кількість доісторичних фолікулів. У цьому дослідженні ми показуємо, що хвиля виснаження первинних фолікулів виникає у мишей під час переходу у доросле життя. Ми показали, що ця раптова і різка втрата первинних фолікулів відбувається гормонально, і визначає проапоптотичний білок лише BH3, модифікуючий фактор BCL-2 (BMF), який є важливим для цього процесу, маючи на увазі внутрішній апоптотичний шлях як ключовий механізм . Ліквідація первинних фолікулів під час статевого дозрівання є не тільки значною подією розвитку, вона також є фізіологічно важливою, оскільки в кінцевому рахунку зменшує доступність первинних фолікулів і визначає тривалість фертильності. У сукупності ці висновки вказують на те, що статеве дозрівання є критичним вікном розвитку для регулювання розміру яєчникового резерву, що впливає на фертильність та репродуктивне довголіття жінок.

Головний

Резерв яєчників невирослих первинних фолікулів представляє весь запас ооцитів, доступних жінкам для підтримки фертильності протягом репродуктивного життя. Більшість первинних фолікулів існують у стані простою, але кілька активуються, щоб розпочати процес фолікулогенезу. Фолікулогенез врешті-решт закінчується фолікулярною атрезією або рідше завершується овуляцією зрілого ооцита. Постійне потрапляння первинних фолікулів у зростаючий пул фолікулів призводить до поступового виснаження яєчникового резерву у міру старіння жінок, причому безпліддя виникає, коли кількість фолікулів опускається нижче критичного порогу. Запас первинних фолікулів може передчасно вичерпатися агентами, що індукують генотоксичний стрес (наприклад, багато протипухлинних препаратів та опромінення), що призводить до апоптозу яйцеклітин та форекулярної атрезії. 3, 4 Однак, наскільки регульований розвитком апоптоз, на відміну від апоптозу, індукованого в результаті впливу конкретних екзогенних подразників, безпосередньо сприяє нормальному постнатальному спаду первинних фолікулів, менш чіткий, і фактори, що впливають на терміни безпліддя, пов'язані з материнською старіння залишається погано охарактеризованим.

Численні дослідження зафіксували чисельне зменшення первинних фолікулів після народження. 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Одне з таких досліджень на мишах показало, що початковий яєчниковий резерв первинних фолікулів виснажується більш ніж на дві третини між постнатальним днем ​​(PN) 6 і 45. 8 Після PN45, коли мишей вважають статевозрілими, первинні фолікули зникали з яєчникового резерву набагато поступово. Виходячи з цих даних та припускаючи постійну швидкість втрат, дослідження математичного моделювання підрахували, що приблизно 80 первинних фолікулів щодня активуються, щоб стати первинними фолікулами, і

150 первинних фолікулів щодня піддаються атрезії в яєчнику неповнолітніх. Таким чином, є дані, які свідчать про те, що апоптоз, що веде до фолікулярної атрофії, може суттєво сприяти зменшенню розміру яєчникового резерву після народження, принаймні у дуже молодих мишей. Однак концепція того, що велика кількість фолікулів може бути втрачена під час важливих подій розвитку після народження, не досліджувалась. Зокрема, кількість первинних фолікулів та динаміка в період статевого дозрівання у мишей не вивчались, а молекулярні механізми, що лежать в основі втрати постнатального фолікула, залишаються мінливими.

результат

Резерв яєчників первинних фолікулів виснажується в процесі, залежному від BMF, у мишей між PN40 і PN50.

Фолікули підраховували в яєчниках мишей WT та Bmf -/- у PN20, 30, 40 та 50, що перевищує період часу, протягом якого самки мишей переходять від неповнолітніх до статевозрілих дорослих (рис. 1а-f). Цей перехідний період називається статевим дозріванням. Кількість первинних фолікулів була однаковою в яєчниках WT та Bmf -/- мишей у PN20, 30 та 40 і залишалася відносно постійною протягом цього часу (Рисунки 1a та e, Додаткові таблиці 1 та 2). Примітно, що кількість первинних фолікулів значно зменшилася між PN40 і PN50 у яєчниках жінок із ЗТ (рис. 1а), але все ще зростала в яєчниках самок Bmf -/-, що вказує на вирішальну роль BMF у цьому виснаженні (рис. 1а, Додаток Таблиці 1 і 2). Зменшення кількості первинних фолікулів у яєчниках ВТ між PN40 і PN50 не було пов’язане із супутнім збільшенням кількості первинних, вторинних або анальних фолікулів, тобто зростаючих фолікулів (рис. 1а - в), і загальна кількість втрата номера фолікула (рис. 1г). Ці дані дозволяють припустити, що виснаження резерву яєчників не було зумовлене підвищеною швидкістю активації первинного фолікула та переходом до зростаючого пулу фолікулів. Натомість ці спостереження узгоджуються з гіпотезою, що приблизно 50% резерву яєчників (

1800 первинних фолікулів) безпосередньо втрачаються протягом цього 10-денного періоду внаслідок BMF-залежної атрофії. Значна втрата первинних фолікулів, як видається, обмежується цим відносно коротким перехідним періодом, оскільки наші попередні дослідження показують, що виснаження первинного резерву набагато поступовіше у дорослих мишей протягом усього репродуктивного життя. Цікаво, що значно більше вторинних та антральних фолікулів було при PN50 у яєчниках самок Bmf -/-, ніж WT мишей (малюнки 1c та f), що, мабуть, свідчить про збільшення виживання у цій популяції фолікулів. Це останнє спостереження відповідає критичній ролі BMF у вторинній та антральній атрезії фолікула, яку ми вже описали раніше. 5

виснажується

Повнорозмірне зображення

Фолікулярна атрезія у підлітків та дорослих WT та Bmf -/- самки мишей

Фолікулярна атрезія яєчників у мишей WT та Bmf -/-. Кількість атретичних фолікулів визначали в яєчниках WT та Bmf -/- мишей у PN20, 30 40 та 50 (n = 6/вік/генотип). ( a ) Репрезентативні зображення атретичних преантральних (вторинних) та антральних фолікулів у пофарбованих PAS ділянках яєчників мишей WT та Bmf -/- на PN50. Атретичні преантральні та антральні фолікули характеризувались наявністю деградуючих ооцитів та/або пікнотичних гранульозних клітин. Шкала = 50 мкм. ( b ) Репрезентативні зображення TUNEL-позитивних аретичних фолікулів (коричневе фарбування) у вторинних фолікулах у відділах яєчників від мишей WT та Bmf -/- при PN50. Шкала = 50 мкм. ( c ) Дані виражаються як середнє значення ± SEM # P -/- проти жінок WT у кожному віці P -/- жінок у кожному віці. Див. Додаткові таблиці 1 та 2 щодо статистичної значущості всіх попарних порівнянь у межах генотипу

Повнорозмірне зображення

Пубертатний перехід у мишей WT та Bmf -/-

Початок статевого дозрівання у мишей WT та Bmf -/-. ( a ) Відсоток мишей WT та Bmf -/- з принаймні одним жовтим тілом, присутнім в їх яєчниках, визначали при PN20, 30, 40 та 50 (n = 6/вік/генотип). Кількість аналізованих мишей показано над кожною колонкою. ( b ) Середня кількість присутніх жовтого тіла на яєчник у мишей WT та Bmf -/- (в аналіз були включені лише миші з принаймні одним жовтим тілом) були визначені в PN20, 30, 40 та 50. Дані виражаються як середнє значення ± SEM (де n = 3 або більше). # P -/- проти WT при PN50 (двоточковий непарний t-тест студента). ( c ) Репрезентативні зображення пофарбованих PAS зрізів яєчників мишей WT та Bmf -/- у PN20, 30, 40 та 50. Позначення "CL" вказує на розташування кожного жовтого тіла. Шкала = 200 мкм

Повнорозмірне зображення

Втрата фолікулів під час статевого дозрівання спричинена гормонально, а не залежно від віку

Хоча незрозуміло, чому в цей час статевого дозрівання усувається така велика кількість фолікулів, два останні дослідження на мишах можуть надати деяку інформацію. 33, 34 Ці дослідження дозволяють припустити, що в яєчниках є дві популяції первинних фолікулів, які виконують різну функціональну роль. 33, 34 Первинні фолікули, які утворюються переважно у фолікулярному фундаменті в яєчнику плода, характеризуються своїм розташуванням у кістковому мозку та швидкою активацією при народженні. Більшість із цих фолікулів втрачаються/використовуються до PN60 і в першу чергу сприяють формуванню функціональної статевої зрілості та ендокринної циклічності. Когорта первинних фолікулів, що виділяються з яєчників під час статевого дозрівання, яку ми охарактеризували в цьому дослідженні, може належати до цієї першої популяції. Друга популяція первинних фолікулів формується трохи пізніше в яєчнику плода, знаходиться в корі яєчників і в першу чергу відповідає за фертильність дорослих. 33, 34 В сукупності ці дані дозволяють припустити, що існують функціональні відмінності в первинних фолікулах до і після статевого дозрівання, і що процеси дозрівання в підлітковому віці, включаючи втрату аномальних фолікулів і підвищену здатність до розвитку фолікулів, можуть бути важливими для формування повністю функціональних фолікулів. дорослий яєчник.

Хоча кількість фолікулів, пов’язаних із статевим дозріванням, спеціально не вивчалася у дівчаток до і після статевого дозрівання (і може бути неможливою через обмежену наявність відповідних зразків тканин), вікові дані свідчать про те, що кількість первинних фолікулів зменшується приблизно один. половина протягом підліткового/молодого дорослого періоду у людей (у віці 13-25 років), 1 подібно до того, що ми спостерігали на нашій моделі миші. Нещодавно було виявлено також, що первинні популяції фолікулів зазнають морфологічних та функціональних змін з віком та статевим дозріванням у людей: 35 майже 20% первинних фолікулів у яєчниках людини до пубертату були аномальними (визначаються як фолікули з надзвичайно великим ооцитом зі слабко забарвленим ядра), які аномальні первинні фолікули ніколи не спостерігались у дорослих тканинах. Автори припустили, що неякісні первинні фолікули були усунені або переважно використані до введення овуляції у зрілому віці. Ці дані дозволяють припустити, що зміни в яєчниках під час статевого дозрівання виходять за межі циклічного набору антральних фолікулів для овуляції та включають зміни в розмірі яєчникового резерву первинних фолікулів.

Підводячи підсумок, ми виявили, що приблизно 50% первинних фолікулів втрачаються безпосередньо із запасу яєчників безпосередньо перед дорослим віком у процесі, який вимагає проапоптотичного білка BMF і викликається гонадотропіном. Ми опублікували статеве дозрівання як важливий момент розвитку, протягом якого резерв яєчників значно виснажується, і, що важливо, ми вже показали, що це зменшення кількості фолікулів в кінцевому рахунку зменшує фертильне життя жінки. Наша робота проливає нове світло на механізми розвитку, які регулюють розмір резервів яєчників і визначають кількість фолікулів, доступних для підтримки фертильності жінок. Крім того, ці дані дають нове розуміння того, як регулюється яєчниковий резерв з часом, показуючи, що замість стабільної втрати первинних фолікулів постнатально, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 36 є активною хвилею втрати фолікулів. це спрацьовує в період статевого дозрівання і призводить до швидкого виснаження фолікулярного басейну.

Матеріали і методи

Миші Bmf -/- на фоні C57BL/6 були описані вище. 13 мишей C57BL/6 (WT) та Bmf -/- утримувались у високотемпературному пристрої з контролем температури (Університет Монаша ARL) із вільним доступом до мишей та води та 12-годинним циклом світло-темрява. Всі процедури та експерименти на тваринах проводились відповідно до Австралійського кодексу догляду та використання тварин NHMRC та затверджені Комітетом з етики тварин Монаша.

Оцінка кількості здорових фолікулів

Для визначення кількості фолікулів використовували об’єктивну стереологію. Стереологія визнана найкращим методом кількісної оцінки клітин у зрізах тканин. 37 Яєчники мишей WT та Bmf -/- (PN20, 30, 40, 50, n = 6/вік/генотип) фіксували в розчині Буена, обробляючи гідроксиетилметакрилатною смолою (Technovit 7100; Kulzer and Co., Friedrichsdorf, Німеччина ), а потім послідовно розподіляють при 20 мкм з мікротомом Leica RM2165 (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Німеччина). Зрізи фарбували періодат-кислотою Шиффа та гематоксиліном. Детально описана методологія стереологічних номерів фолікулів. 6, 38 Коротше кажучи, на мікроскопі Olympus BX50 (Токіо, Японія) ми використовували занурювальну лінзу × 100 із фазою Autoscan (Autoscan Systems Pty Ltd, Мельбурн, Вікторія, Австралія), яка контролювалась стереологічною системою StereoInvestigator (версія 11.06.02, MBF Bioscience 2015, MicroBrightField, Inc., Williston, VT, USA). Кожну третю порцію підраховували, а кількість фолікулів визначали множенням кількості необроблених ооцитів, взятих (Q -), на всі три фракції відбору проб (1/f1, 1/f2 та 1/f3). 38

Оцінка кількості атретичних фолікулів

Кількість атретичних фолікулів підраховували в послідовних зрізах глікометакрилату 20 мкм по всьому яєчнику, використовуючи метод фракціонування/фізичної дисекції, як описано вище. Первинні, первинні та вторинні фолікули класифікували як атретичні, якщо вони містили вироджений ооцит (позначений нерегулярно прискореною плазматичною мембраною або фрагментованою міхуркою зародкової лінії), або якщо клітини гранульози були фрагментовані або мали злиті пікнотичні ядра. Антральні фолікули вважалися атретичними, якщо більше 10% їх гранульозних клітин були апоптотичними або якщо вони містили дегенеруючий ооцит.

Рейтинг статевого дозрівання: числа жовтих тіл

Кількість жовтих тіл визначали шляхом прямого підрахунку кожні шість послідовних ділянок глікометакрилату 20 мкм, що містять весь яєчник. Сусідні зрізи оцінювали, щоб переконатись, що кожен жовтого тіла був підрахований лише один раз.

Придушення статевого дозрівання

Антагоніст гонадотропін-рилізинг-гормону Цетрорелікс (Sigma, Castle Hill, NSW, Австралія, Кат. № 5249) використовувався для затримки статевого дозрівання у мишей з ВТ із використанням добових доз, як описано вище у гризунів. 39, 40, 41 Ін'єкції (0,1 мл) сольового розчину або цетрореліксу (0,5 мг/кг маси тіла/добу) вводили підшкірно щодня протягом 25 днів (n = 6 мишей/група). Лікування розпочали до настання статевого дозрівання, яке у самок мишей спочатку виявляється як вагінальне отвір, яке відбувається приблизно при PN28 +/− 2 в нашій колонії миші. Тому лікування починали з PN25 і продовжували до кінця експерименту при PN50. За всіма тваринами спостерігали щодня шляхом візуального огляду на вагінальний отвір. Як тільки спостерігалося розкриття піхви, вагінальні мазки збирали щодня для контролю ефірів.

Стимуляція хоріонічним гонадотропіном коней та хоріонічним гонадотропіном людини

Сексуально незрілим самкам мишей WT PN20 вводили фізіологічний розчин (контролі) або хоріонічний гонадотропін коней (eCG, 5 МО), а потім через 44-48 годин ін’єкцію хоріонічного гонадотропіну людини (hCG, 5 МО) (n = 6/група). У PN30 збирали яєчники та підраховували первинні фолікули.

ТУНЕЛЬ забарвлення

Для виявлення апоптотичних клітин у відділах яєчників використовували набір для виявлення апоптозу для виявлення апоптозу в ситуації (Chemicon International, Мельбурн, Австралія) відповідно до інструкцій виробника. Апоптотичні клітини візуалізували додаванням 0,05% DAB хромагену (Sigma, Castle Hill, NSW, Австралія), а зрізи фарбували за допомогою чистого гематоксиліну Гарріса. Для кожної тварини оцінювали щонайменше три випадково вибраних предметних стекла (n = 6). Позитивний контроль проводили шляхом впливу препаратів DNAseI (відповідно до інструкцій набору). Один слайд використовували на кожному слайді для аналізу TUNEL, тоді як інший служив негативним контролем (без додавання TdT).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM, а статистичний аналіз кількості фолікулів проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Зазвичай розподілені дані аналізували за допомогою t-критерію студента для попарних порівнянь або одностороннього ANOVA, а значимість визначали за допомогою багаторазового порівняльного тесту Tukeys. Відмінності вважалися суттєвими, коли Р