Роль автофагічних генів у регуляції нейрональної смерті, розміру клітин та процесу старіння у Caenorhabditis elegans Докторська дисертація Мартон Лоран Тот Етвес Університет Лорана Докторська школа біології Докторська школа класичної та молекулярної генетики Докторська програма Докторська програма Докторська програма Анна Ердей Керівник академічної програми: д-р. Ласло Орош Академічний керівник: д-р. Тибор Веллай Доцент Університету Етвеша Лоранда Факультет природничих наук Відділ генетики Будапешт 2008

генів

Зміст ЗМІСТ 2 СПИСОК СКОРОЧЕНЬ 5 1. ВСТУП 6 2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 7 2.1. Автофагія 7 2.1.1. Початкові кроки в регулюванні макроавтофагії 9 2.1.2. Роль аутофагії у функціонуванні клітин 11 2.2. C. elegans модель організму 13 2.3. Нейродегенеративні захворювання 15 2.3.1. Класифікація нейродегенеративних захворювань 15 2.3.2. Моделі тварин, що використовуються для вивчення нейродегенеративних захворювань 17 2.3.2.1. Моделі, засновані на агрегації 17 2.3.2.2. Екситотоксичні моделі 17 2.4. Регулювання розміру клітини 21 2.5. Біологія процесу старіння 24 2.5.1. Товариства, що старіють 24 2.5.2. Теорії старіння 25 2.5.3. Процес старіння 26 2.5.4. Основні генетичні та екологічні фактори, що впливають на старіння 27 2.5.4.1. Сигнальний шлях інсуліну/IGF-1 27 2.5.4.2. TOR кіназа 28 2.5.4.3. Обмеження калорій 28 2.5.4.4. Мітохондріальний дихальний ланцюг 28 2.5.4.5. Вплив аутофагічних генів на тривалість життя 29 2.5.5. Вивчення процесу старіння 29 3. ЗАВДАННЯ 31 3.1. Дослідження ролі автофагічних генів у нейродегенерації 31 3.2. Дослідження ролі автофагічних генів у регуляції розміру клітин 31 3.3. Дослідження ролі автофагічних генів у регуляції процесу старіння 31 4. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 33 4.1. Обстежені аутофагічні гени 33 4.2. Обслуговування запасу 34 4.3. Втручання РНК 34 2

6.2. Гени аутофагів bec-1 та unc-51 необхідні для нормальної функції аутофагії у C. elegans 70 6.3. Автофагічні гени необхідні для нейродегенеративних процесів, спричинених дегенерином та 6-OHDA 71 6.4. Для формування нормального розміру клітин у C. elegans 75 6.5 необхідні автофагічні гени. Автофагічні гени впливають на процес старіння 76 7. РЕЗЮМЕ 81 8. РЕЗЮМЕ 82 9. БІБЛІОГРАФІЯ 83 10. ПОДЯКИ 95 4

Рисунок 1. Основні типи аутофагії. В: під час макроавтофагії деякі цитоплазматичні компоненти укладені отриманою ізоляційною мембраною (секвестрація). Зовнішня мембрана (первинної) аутофагосоми або аутофагічної вакуолі, оточена подвійною ізоляційною мембраною, зливається з лізосомою (злиття). Лізосомні протонні насоси підкислюють внутрішню поверхню вторинної лізосоми або аутофаголізосоми, активуючи тим самим лізосомні гідролази та погіршуючи вміст (деградація). Б: під час мікроавтофагії цитоплазматичні компоненти, що оточують лізосому, потрапляють у внутрішню частину лізосоми разом з мембраною лізосоми (інвагінація), де вони деградують (деградація). C: під час шаперон-опосередкованої аутофагії (CMA) білки, що мають мотив KFERQ, розпізнаються цитоплазматичними шаперонами (розпізнавання). Білковий комплекс шаперон-субстрат транспортується до мембранних рецепторів лізосоми. Через рецептор білок потрапляє всередину лізосоми (транслокація), а потім деградує (деградація). Структури, показані на малюнку, є схематичними. 8

Рисунок 2. Початкові етапи регулювання макроавтофагії. Активність комплексу Atg1, необхідна для ініціювання через комплекс TOR, визначається сигнальним шляхом інсулін/igf-1 та AMPK. Ініціація також вимагає зародження везикул, деталі якого невідомі. 2.1.2. Роль аутофагії у функціонуванні клітин Аутофагія є механізмом розпаду клітинних матеріалів. На додаток до протеасоми, аутофагія є найбільш значущою кількісно системою деградації білка [2]. Його активація може бути викликана нестачею енергії, спричиненою голодуванням, або нестачею амінокислот та сполук азоту, необхідних для побудови метаболічних процесів, або накопиченням пошкоджених макромолекул. Аутофагія відіграє важливу роль у регуляції багатьох окремих процесів розвитку та цитологічних процесів. Наприклад, личинне тіло личинок Drosophila melanogaster деградує внаслідок аутофагії [6], або ендоплазматичного ретикулума та мітохондрій у ссавців після утворення еритроцитів після викиду ядра [7, 8]. Аутофагія необхідна під час імунної функції ссавців для презентації антигену за допомогою MHCII [9, 10]. Він грає роль у захисті від патогенних мікроорганізмів та знищенні внутрішньоклітинних паразитів (наприклад, мікобактерій, вірусів) [11, 12]. 11

Рисунок 4. Життєвий цикл C. elegans. Час генерації C. elegans становить лише 3 дні при 25 C. Основними етапами життєвого циклу є: ембріогенез всередині закритого яєчника; розвиток личинок, включаючи 4 стадії личинки, розділені умовами спокою, які називаються млявістю і подальшим осипанням після вилуплення, а потім і в зрілому віці. Після стадії личинки L1, альтернативна стадія личинки L3, личинка Дауера, може розвинутися в результаті високої температури, недоїдання або так званого перкуторного феромону. Знання, накопичені роками, містяться в одній з перших інтегрованих баз даних, WormBase (www.wormbase.org). Базу даних зображень можна отримати на веб-сайті Wormatlas (www.wormatlas.org). У Wormbook (www.wormbook.org) є кілька постійно оновлюваних джерел літератури. Міжнародна основна колекція зберігається в Університеті Міннесоти (CGC: Caenorhabditis Genetics Center, http://dbw.msi.umn.edu/cgcdb/search.php). Дослідження нематод C. elegans було присуджено Нобелівську премію з медицини у 2002 р. (Сідней Бреннер, Джон Сулстон та Роберт Х. Хорвіц) та 2006 р. (Ендрю З. Фаєр та Крейг С. Мелло). 14

Рисунок 13 Частка людей у ​​віці старше 64 років у світі у 2007 році. (World Population Data Sheet 2007, http://www.prb.org/). 2.5.2. Теорії старіння Ряд теорій старіння народився на еволюційній та механістичній основі (табл. 1). Зазвичай вони вивчали складний процес старіння лише з однієї точки зору. Останні теорії були розроблені на основі теорії мережі з урахуванням інших теорій [87]. 25

зі швидкістю процесу старіння з часом це призводить до рухових розладів, а потім і до повного паралічу. Іншим корисним маркером старіння є внутрішньоклітинне співвідношення АМФ/АТФ, яке поступово зростає в міру прогресування старіння клітин [114]. У людській медицині цей метод звичайно застосовується більше 20 років [115]). Специфічним методом C. elegans є вимірювання термотолерантності [116, 117]. При цьому стійкість тварин до загального теплового стресу вимірюється шляхом контролю їх здатності протистояти смертельній температурі 35 ° C. Це опосередковано пов’язано зі здатністю виробляти білки теплового шоку, яка разом із термотолерантністю зменшується зі старінням [118]. Дослідження нагнітання глотки та визначення частоти дефекації також специфічні для C. elegans: обидва виявляють зменшення зі старінням [113]. 30

мутації, що зменшують активність опосередкованих інсуліном/igf або TOR-кіназою сигнальних шляхів, функції мітохондрій та засвоєння калорій, значно збільшують тривалість життя у філогенетично віддалених видів тварин. У своїх експериментах я досліджував роль аутофагічних генів у старінні, вимірюючи тривалість життя та накопичення пігменту, що старіє, та контролюючи дегенерацію м’язів. Далі я досліджував взаємодію між аутофагічними генами та раніше описаними генетичними шляхами, що беруть участь у регуляції життя. 32

Я інкубував 6-гідроксидопамін у 10 мМ розчині аскорбінової кислоти протягом 60 хв. Після обробки тварин поміщали на порожню тарілку NGM. Через 24 години після лікування кількість пошкоджених дендритів та кількість загиблих дофамінергічних нейронів визначали за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Рисунок 15. 8 дофамінергічних нейронів C. elegans та їх випинань можна добре ідентифікувати за допомогою конструкції pdat-1: gfp. На малюнку показано флуоресцентне мікроскопічне зображення переднього тіла молодої людини, глотки та прилеглої ділянки. З 8 клітин, що експресують транспортер дофаміну DAT-1, видно лише 6, з 2 додатковими дофамінергічними нейронами (PDEL та PDER), розташованими в задній половині тварини. Малюнок 16. Лікування 6-OHDA спричиняє відмирання дофамінергічних нейрональних протрузій, а деякі нейрони відмирають. Цей процес можна добре спостерігати у тварин генотипу pdat-1: gfp за допомогою флуоресцентної мікроскопії. В: Лікована 6-OHDA тварина генотипу pdat-1: gfp з 4 вижилими дофамінергічними нейронами (клітина ADE 2 не в фокусі) та фрагментованими залишками їх випинань. B: Тварина, оброблена 6-OHDA, з генотипом pdat-1: gfp з вищим ступенем дегенерації лише з 2 вижилими нейронами. C: Оброблена 6-OHDA pdat-1: тварина генотипу gfp, у якій були вбиті майже всі мічені GFP нейрони. 37

Вмираючі та мічені GFP клітини завжди підраховували при однаковій температурі у тварин із синхронізованої популяції з контролем. Експерименти проводились із мікроскопом Zeiss Axiovert 135, оснащеним оптикою Номарського, у 0,1 мм концентрації розчину левамизола, що капав на тонку агарову пластинку, сформовану на предметному склі. Я також проводив спостереження на місцях на пластинах NGM з мікроскопом Zeiss Axioskop 20, збільшенням 10, 20 та сорок. Статистичний аналіз отриманих даних проводили за допомогою двовибіркового t-критерію (статистична програма SPSS 14). Відмінності с