реферат

Зростаюча роль NHERF у клітинній фізіології. NHERF містить два тандемні та високо гомологічні домени PDZ (амінокислоти 11-97 представляють PDZ-I - діагональні смуги) та амінокислоти 150-237 утворюють PDZ-II (плитковий малюнок), а також С-кінцеву область приблизно 30 амінокислот кислоти, асоціюється з членами ERM сімейства мембранно-цитоскелетних адаптерів (пунктир). Хоча багато клітинних білків пов'язують PDZ-I, було показано, що кілька білків пов'язують PDZ-II. NHE3 пов'язує область, що міститься в PDZ-II і С-кінці. Точний характер цієї асоціації залишається невідомим. Потрібно дослідити взаємозв'язок структури та функції для інших цілей NHERF, таких як котранспортер Na/Pi типу IIA та котранспортер Na/HCO3. Метаболічне маркування вказує на те, що NHERF конститутивно фосфорилюється в серині-289 (показано у вигляді зірки)

nherf

Повнорозмірне зображення

Розвиток ролі NHERF у клітинній фізіології: від транспорту іонів до передачі сигналу

NHERF, мембранно-цитоскелетний адаптер. Дослідження регуляції NHE3 у багатьох лабораторіях вказують на утворений комплекс NHE3 з NHERF та езріном, який пов'язує комплекс з цитоскелетом актину під верхівковими мембранами. Есрін також позиціонує РКА для фосфорилювання одного або декількох ділянок (позначених зірками) на цитоплазматичному кінці NHE3 для регулювання транспортної активності NHE3 та переробки. Сигнали фактора росту, опосередковані малим GTP-зв’язуючим білком, Rho, активують ROCK-протеїнкіназу, яка фосфорилює С-кінцеву ділянку (показану у вигляді зірки) в езріні, перетворюючи його з інертних розчинних димерів у функціональні мономерні адаптери, які зв’язуються з обома NHERF та актин для регулювання. NHE3 та інші мішені

Повнорозмірне зображення

Пізніші дослідження виявили ще одну функцію асоціації NHERF з P2A, а саме - визначення долі інтерналізованого рецептора під час десенсибілізації, спричиненої агоністами (Cao et al., 1999). Дані свідчать про те, що асоційований з NH2F p2 AR легше переробляється на поверхню клітини під час повторної сенсибілізації. Однак асоціація NHERF була порушена GRK-5 (ізоформою рецептора кінази, пов'язаної з G-білком), опосередкованою фосфорилюванням P2 AR в межах С-кінцевого PDZ-зв'язуючого мотиву. Це призвело до перенаправлення рецепторів та деградації в лізосомах. Ці дослідження показали, що, як видно з NHE3, NHERF відіграє кілька ролей у регулюванні сигналізації β-адренергічних рецепторів.

NHERF, підсилювач сигналу з фактором росту

NHERF, нова роль у сигналізації фактору росту. Димеризація та активація тирозинкінази рецептора PDGF полегшується або стабілізується завдяки зв'язуванню з доменом NHERF PDZ-I. Здатність NHERF утворювати гомодимери може сприяти активації PDGFR та ініціювати мітогенні сигнали через шляхи PI 3-кінази та MAP-кінази. Аналогічним чином, димерний NHERF може також сприяти асоціації кальцієвого каналу Trp4 з ізоформами Cp фосфоліпази, обидві з яких зв'язують NHERF PDZ-I, для регулювання метаболізму кальцію та фосфоїнозиту та активації сигналів протеїнкінази C, необхідних для росту клітин.

Повнорозмірне зображення

NHERF: націлювання на нерецепторні тирозинкінази

Під час десенсибілізації p2 AR в рецепторний комплекс включається нерецепторна тирозинкіназа, c-Src. Form-арестин, фосфопротеїновий модулятор сигналізації P2B, та активований c-Src необхідні для формування лунок, покритих клатрином, що сприяють ендоцитозу β2 AR (Ahn et al., 1999). Набір c-Src також ініціює активацію ERK β-агоністом і ініціює мітогенну сигналізацію. Оскільки NHERF вибірково асоціюється з кластеризованим p2 AR (ref), між NHERF та β-арсетином може існувати перехресний зв’язок, який також зв'язує цитоплазматичний хвіст p2 AR залежно від агоністів для контролю інтерналізації та флуктуації. P2 AR і модулюють опосередковані c-Src сигнали, які регулюють ріст клітин.

Метаболізм NHERF та фосфоїнозитиду

Недавні спостереження, що PDZ-II у NHERF-2/E3KARP зв'язує фосфоліпазу Cp3 та посилює її активність у множинних клітинних лініях, свідчать про важливу роль NHERF у передачі сигналів про фосфоїнозитид (Hwang et al., 2000). Фосфоліпаза Cp3 розщеплює PIP 2 на дві ключові сигнальні молекули - діацилгліцерин та IP3. Подальша активація рецептора IP3, пов’язаного з ендоплазматичною сіткою, мобілізує внутрішньоклітинні запаси Са 2+, які спільно з діацилгліцерином активують протеїнкіназу С та сприяють мітогенній передачі сигналів. Збільшення внутрішньоклітинного кальцію або кальцієвого наконечника, у свою чергу, ініціює приплив позаклітинного Са 2+ через кальцієві канали (SOC), які зберігаються у резервуарах, на плазматичну мембрану та заповнює виснажені внутрішні резервуари. Таким чином, SOC відіграють важливу роль у регуляції внутрішньоклітинного кальцію. Недавній звіт припускає, що NHERF-1 PDZ-I асоціюється з двома SOC ссавців, Trp4 і Trp5, а також фосфоліпазами Cpl і Cp2 (Tang et al., 2000). Оскільки SOC і PLCβ співіснують в комплексі з NHERF, він припускає, що NHERF може поєднувати функції SOC з PLCp (рис. 3) для координації метаболізму кальцію та фосфоїнозиту та контролю метаболізму та росту клітин.

NHERF, головна мішень білків ERM

NHERF людини був виділений як EBP-50, або білок, що зв'язує езрін, приблизно приблизно 50000 (Reczek et al., 1997) і пов'язує більшість членів сімейства ERM цитоскелетних білків, які зв'язують мембранні білки з основним актиновим цитоскелетом. Білки ERM також визначають структури плазматичної мембрани, такі як мікровілли, розташовані на апікальній поверхні поляризованих клітин епітелію. Багато клітин містять неактивні гомо- та гетеродимери езрину, зв’язані з іншими білками ERM, які не здатні зв’язуватися ні з NHERF, ні з F-актином (Nguyen et al., 2001). Однак фактори росту сприяють фосфорилюванню С-кінцевого залишку в езріні (і моєзині) або за допомогою PKC0, або активованої RhoA протеїнкінази ROCK, і активують езрін, перетворюючи його в мономерну форму, яка легко асоціюється з NHERF Bretscher, 1999). Таким чином, цікаво відзначити, що Rho, але не тісно пов'язані між собою малі GTP-зв'язуючі білки, Rac1 або Cdc42, регулює активність NHE3, мабуть, збільшуючи доступність ERM-білків за рахунок збільшення їх фосфорилювання за допомогою ROCK (Szaszi et al., 2000).

Merlin, член сімейства білків-адаптерів ERM і продукт гена нейрофіброматозу 2 (NF2), безпосередньо пов'язаний з регуляцією росту. NF2 в значній мірі мутує в домінантне спадкове захворювання, яке схиляє пацієнтів до шванном та менінгіом (Stokowski and Cox, 2000). Мутації людини NF2 пов'язані з важкою захворюваністю, яка скорочує тривалість життя постраждалих людей менше ніж до 40 років. Мерлін, як і інші білки ERM, зв'язується з NHERF через свій N-кінцевий домен ERM. Більше 80% хвороботворних мутацій, виявлених у домені ERM, призводять до значно нижчої спорідненості мутантних білків мерліну до NHERF і свідчать про те, що NHERF відіграє ключову роль у супресорній активності мерліну.

Есрін також відіграє дозвільну роль у опосередкованій РОК трансформації фібробластів онкогенами Net та Dbl (Tran Quang et al., 2000). І Net, і Dbl є обома факторами обміну гуанінових нуклеотидів, що сприяють навантаженню GTP та активації Rho. Онкогенні або гіперактивовані форми Net та Dbl призводять до накопичення активованого Rho та збільшення переданих Rho проліферативних сигналів. Ефекти, що стимулюють ріст Rho-GTP, також вимагають С-кінцевого фосфорилювання та активації езріну, а мутантний езрін, який не має критичного місця фосфорилювання, пригнічує трансформацію клітин онкогенами Net та Dbl.

Есрин також надмірно експресується і сильно фосфорилюється в cFos-трансформованих фібробластах (Lamb et al., 1997). Крім того, надмірна експресія та фосфорилювання езрину корелювала зі зміною форми та рухливості клітин, що, ймовірно, відображає підвищені інвазивні властивості злоякісних клітин. Лазерна інактивація есріну за допомогою хромофору (CALI) призводить до втягування псевдоподіальних виступів з акцентом на його роль у міграції клітин (Jay and Sakurai, 1999). Інші білки ERM, такі як радіксин та мізин, регулюються вниз при аденокарциномі легенів порівняно з нормальною легеневою тканиною (Tokunou et al., 2000). Нарешті, новий член сімейства ERM, Ehm2, сильно експресується в клітинах меланоми миші (Shimizu et al., 2000). Ці дослідження дозволяють припустити, що зміни клітинного профілю білків ERM та їх асоціації з NHERF, основною мішенню білків ERM в епітеліальних клітинах, можуть сприяти передачі сигналів, які контролюють ріст і трансформацію клітин.

NHERF та рак людини

NHERF нещодавно було визначено як іРНК, яка сильно індукується естрогеном у клітинах раку молочної залози, позитивних до естрогенних рецепторів (ER) (Ediger et al., 1999; Stemmer-Rachamimov et al., 2001). Естроген підвищував рівень мРНК NHERF та білка в клітинах ER (+) MCF7. На відміну від цього, експресія рецепторів естрогену в клітинах ER (-) відновила здатність естрогену індукувати експресію NHERF у цих клітинах. Ці та інші експерименти визначали NHERF як індукований естрогеном ген. Однак прямий аналіз мишачого гена NHERF не зумів виявити естроген-чутливий елемент (и), і механізм регуляції NHERF естрогеном залишається невідомим (Weinman et al., 1999).

Широкий аналіз людських ER (+) та ER (-) клітин раку молочної залози ще більше посилив зв'язок між експресією NHERF та естрогензалежним ростом при первинних ракових пухлинах молочної залози (Stemmer-Rachamimov et al., 2001). Імуногістохімічні дослідження показали, що експресія NHERF була збільшена в пухлинах молочної залози порівняно з сусідньою нормальною тканиною молочної залози, тим самим сприяючи ролі NHERF у розвитку пухлини. У зв'язку з цим сигнали PDGF посилюються при раку молочної залози людини і беруть участь у прогресуванні пухлини (Shao et al., 2000). Завдяки запропонованій ролі NHERF-1 та NHERF-2 у сприянні димеризації PDGFR та активації мітогенних сигналів, підвищена експресія NHERF може бути фактором, що сприяє проліферації клітин при більш злоякісних формах раку молочної залози. Нарешті, ген NHERF людини знаходиться в хромосомі 17q25.1, області, яка часто мутується при раку молочної залози та яєчників людини (GenBank access # NM_004252; Kalikin et al., 1996, 1997). Недоліки в експресії NHERF також можуть призвести до порушень сигналізації росту та призвести до раку людини.

Зміни обміну Na +/H + відіграють певну роль у псевдоподіальній проліферації пухлинних клітин (Lagana et al., 2000) та проліферації клітин. NHE3, яка є переважною ізоформою NHE в епітеліальних клітинах, може діяти спільно з NHERF для регулювання проліферації та інвазивної здатності раку молочної залози, яєчників та шлунково-кишкового тракту.

Прикінцеві зауваження

За останні роки було досягнуто значного прогресу у розширенні ролі NHERF на багато аспектів біології клітин епітелію. Зростаючі докази також вказують на зміну експресії NHERF та/або функції при захворюваннях людини, включаючи гіпертонію, гостру ниркову недостатність та рак молочної залози. Однак багато біохімічних властивостей NHERF, таких як перелічені нижче, все ще недостатньо вивчені.

Регулювання димеризації NHERF

Вміст NHERF у нирковій тканині значно перевищує вміст відомих цілей, і хоча кількість цілей NHERF продовжує зростати, все ще існують серйозні питання щодо доступності всіх клітинних NHERF до його цілей. Природна тенденція NHERF до утворення димерів може надавати додаткові ознаки для його фізіологічної регуляції. Хоча нові дані свідчать про те, що димерний NHERF діє для регулювання деяких цілей, таких як CFTR (Ahn et al., 2001) та PDGFR (Maudsley et al., 2000), інші функції, включаючи регулювання NHE3, можуть використовувати мономерний NHERF. Недавні дослідження показують, що димеризація NHERF може регулюватися фосфорилюванням білка, оскільки обробка клітин окадаєвою кислотою, інгібітором білкової серин/треонінфосфатази та потужним промотором пухлини сильно зменшує димеризацію NHERF (Shenolikar et al., 2001). Фізіологічні механізми, що регулюють димеризацію NHERF, також можуть відігравати важливу роль у диктуванні наявності та функції NHERF в епітеліальних клітинах.

Роль фосфорилювання NHERF

Дослідження метаболічного маркування показали, що NHERF є фосфопротеїном у клітинах ссавців (Weinman et al., 1995). Холл та ін. (1999) показали, що GRK6A, зв’язана з G-білком ізоформа рецепторної кінази, є основною кіназою NHERF в клітинах HEK293. Цікаво, що GRK6A зв'язується з NHERF PDZ-I (і PDZ-II) для сприяння фосфорилюванню NHERF. Однак клітинні сигнали, які модулюють поглинання GRK6A та фосфорилювання NHERF, або роль ковалентної модифікації на серині-289 (рис. 1) для функції NHERF невідомі.

Конкуренція між цілями NHERF

Експериментальні дані показують, що p2 AR (Hall et al., 1998b) і CFTR (Ahn et al., 2001) пов'язують PDZ-I, але все ще конкурують з NHE3, який переважно асоціюється з PDZ-II та С-кінцем NHERF та таким чином збільшується обмін Na +/H +. У міру збільшення кількості цілей NHERF потрібно дослідити потенційну роль конкуренції між цілями NHERF, а саме ті, що залучають або PDZ-I, або PDZ-II, а також фізіологічні сигнали, що змінюють спорідненість NHERF до певних клітинних цілей, перенаправляючи його функції .

Підводячи підсумок, останні дослідження показують, що NHERF регулює численні сигнальні шляхи, які беруть участь у зростанні та функціонуванні епітеліальних клітин. Крім того, нові дані вказують на NHERF як фактор, що сприяє розвитку раку людини. Завданням для майбутніх досліджень буде визначити опосередковані NHERF події, які є суттєвими для нормальної фізіології клітини, та з’ясувати ефект аберрантної експресії NHERF та функції при трансформації епітеліальних клітин.

Дякую

Дослідження NHERF у лабораторіях Вейнмана та Шенолікара підтримуються грантами NIH DK55881 (EJ Weinman та S Shenolikar) та Доповідями ветеранів (EJ Weinman). JW Voltz підтримується хижацькою громадою Міністерства оборони від раку молочної залози (DAMD-17-98-1-8070).