ТИПИФІКАЦІЯ ВІРУСУ ВПЛ ЛЮДИНИ ПАПІЛОМИ І ЇЇ ВЗАЄМОЗАПЕЧЕННЯ З ХАРАКТЕРИСТИКАМИ НАСЕЛЕННЯ ТА ТРАВМАМИ РАКУ МАТКОВОЇ ШИИ ЖІНОК МУНІЦАЛЬНОСТІ ПАСТО СІНДІ НАТАЛІ НІКОЛА БАНАВІДАРСЬКИЙ БАНАВІДАРСЬКИЙ БАНАВІДАРС

nicola

ТИПИФІКАЦІЯ ВІРУСУ ВПЛ ЛЮДИНИ ПАПІЛОМИ ТА ЙОГО ВІДНОСИНИ ДО ХАРАКТЕРИСТИКИ НАСЕЛЕННЯ ТА ТРАВМ В РАКУ МАТКИ ШИНИ ЖІНОК МІСЦЕВОГО ПАСТО СИНДІ НАТАЛІ НІКОЛА БЕНАВІДС Магістр Наук Мікробіологія УНІВЕРСИТЕТ НАРІНО ФАКУЛЬТЕТ ТОЧНИХ І ПРИРОДНИХ НАУК КАФЕДРА БІОЛОГІЇ САН-ДЖУАН ДЕ ПАСТО 2014 2

Ідеї ​​та висновки, викладені в дипломній роботі, є виключним обов'язком автора. Стаття 1 № 324 від 11 жовтня 1966 р., Видана Почесною Радою Верховного директора Університету Наріньо. 3

Примітка про прийняття Мілена Герреро Флорес Директор Доллі Марго Ревело Ромо Хурадо Едіт Марієла Бурбано Розеро Хурадо Сан Хуан де Пасто, травень 2014 р. 4

Моїм колегам Хуану Пабло, Ванессі, Діані, Ніксону, Карлосу, Кароліні, Маріо, Хуану Густаво, Марселі, Крістіану для їхньої компанії. Всім велике спасибі. 6

ПОСВІТЛЕННЯ Тобі, Боже, що ти дав мені сили, енергії та любові завершити це розслідування. Моїм батькам Хосе Ніколі та Сесілії Бенавідес, моїм братам Рікардо, Діані, Девіду і Маурісіо, які завжди підтримували мене і вірили в мене, даруючи мені свою любов і розуміння. Моїм колегам за всю допомогу, слова підтримки, поради та добру енергію. 7

ЗМІСТ ВСТУП. 23 1. ЗАВДАННЯ. 26 1.1 ЗАГАЛЬНА ЦІЛЬ. 26 1.2 СПЕЦІАЛЬНІ ЦІЛІ. 26 2. СТАН МИСТЕЦТВА. 27 2.1 ВІРУС ПАПІЛОМИ ЛЮДИНИ - ВПЛ. 27 2.1.1 Типи та класифікація ВПЛ. 27 2.1.2 Геном і структура ВПЛ. 29 2.1.3 Опис регіонів геному ВПЛ. 30 2.1.4 Область пізнього виразу L1 та L2. 31 2.1.5 Варіанти вірусу папіломи людини. 32 2.2 ВПЛ та рак шийки матки. 33 2.3 Природознавство КСУ. 36 2.4 Виявлення та молекулярний типізація ВПЛ. 38 2.5 Фактори ризику в ЦКУ. 41 2.5.1 Кількість статевих партнерів. 41 2.5.2 Вік початку статевого акту. 41 2.5.3 Застосування оральних контрацептивів. 42 2.5.4 Зараження іншими організмами. 42 2.5.5 Куріння. 43 8

2.5.6 Кількість вагітностей. 43 2,5 7 Звичайна цитологія. 44 3. МЕТОДОЛОГІЯ. 46 3.1 Опис досліджуваної сукупності. 46 3.1.1 Етичні міркування. 47 3.1.2 Критерії включення. 47 3.1.3 Критерії виключення. 47 3.1.4 Змінні популяції, розглянуті в дослідженні. 47 3.1.5 Розмір вибірки. 47 3.2 Реєстрація інформації, включення зразків, транспортування та збереження. 47 3.2.1 Реєстр інформації про населення. 47 3.2.2 Одновимірний аналіз. 48 3.2.3 Включення зразків. 48 3.3 Обробка зразків для молекулярної типізації ВПЛ. 48 3.4 Аналіз якості зразків методом ПЛР β-глобіну. 49 Підготовка зразків до аналізу якості. 49 3.4.1 Оцінка якості зразка за допомогою ампліфікації ПЛР/HHB. 49 3.4.2 Перевірка продуктів ПЛР/HHB за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. 51 3.4.3 Інтерпретація результатів ПЛР/HHB. 51 3.5 Виявлення та молекулярний типізація ВПЛ. 51 3.5.1 Набір тексту за допомогою зворотного штрихування. 52 3.5.2 PCR-L1 GP5 +/GP6 + та секвенування ДНК. 56 9

4.3.1 Популяційні характеристики жінок з цитологією (-), ASCUS та ВПЛ-інфекцією. 87 4.3.1.1 Соціодемографічні характеристики та інфекція ВПЛ. 87 4.3.1.1.1 Вік та інфікування ВПЛ. 88 4.3.1.1.2 Кількість статевих партнерів та зараження ВПЛ. 89 4.3.1.2 Гінеко-акушерські характеристики та інфекція ВПЛ. 91 4.3.1.2.1 Метод планування та зараження ВПЛ. 4.3.1.2.2 Інші організми та ВПЛ-інфекція. 93 4.3.1.3 Реактивні клітинні зміни, пов’язані із запаленням та зараженням ВПЛ. 93 4.3.2 Аналіз жінок із ураженнями LIEBG, LIEAG, CCU та ВПЛ. 94 4.3.2.1 Вік жінок з LIEBG, LIEAG та CCU та ВПЛ-інфекцією. 94 4.3.2.2 LIEBG, LIEAG, ураження CCU та інфікування ВПЛ. 96 4.3.2.3 LIEBG, LIEAG, ураження CCU та типи ВПЛ. 100 ВИСНОВКИ. 102 РЕКОМЕНДАЦІЇ. 104 БІБЛІОГРАФІЯ. 105 ДОДАТКИ. 127 11

Таблиця 23. Частота зараження ВПЛ відповідно до віку жінок з ЛІЕБГ, ЛІАГ та ККУ. 95 Таблиця 24. Частота інфікування ВПЛ у жінок з LIEBG, LIEAG та CCU. 97 Таблиця 25. Частота типів ВПЛ, виявлених у жінок з LIEBG, LIEAG та CCU. 100 13

СПИСОК ФІГУР Рисунок 1. Філогенетичне дерево послідовностей LCR HPV 16. 28 Рисунок 2. Геном вірусу папіломи людини. 29 Рисунок 3. Природна історія онкогенезу ВПЛ шийки матки. 36 Рисунок 4. Гістологічний розвиток раку шийки матки. 38 Рисунок 5. Плоскоклітинна атипія (ASC-US). 45 Рисунок 6. Карта муніципалітету Пасто, де розташовані місця включення зразків. 46 Рисунок 7. Кільцювання праймерів PCO3 та PCO4 у гені β-глобіну людини, положення 13 нта при 123 нтг. 50 Рисунок 8. Представлення місця кільцювання праймерів GP5 + і GP6 + в геномі HPV 18, положення 6600 нта при 6744 нтг. 52 Рисунок 9. Ампліфікація гена β-глобіну в зразках для чищення шийки матки. 73 Рисунок 10. Ампліфікація гена β-глобіну у зразках біопсії. 74 Рисунок 11. Аналіз оптимізації Mg ++. 77 Рисунок 12. Ампліфікація гена ВПЛ L1. 77 Рисунок 13. Вирівнювання послідовності, визначеної у зразку UDN 217, Blastn та MegaBlast від NCBI. 80 14

СПИСОК ДОДАТКІВ Додаток А. Форма інформованої згоди. 127 Додаток B. Формат клінічної історії профілактики раку. 132 Додаток C. Формат результатів цитології. 133 Додаток D. Аналіз оптимізації Mg ++ для ПЛР/L1 GP5 +/GP6 +. 133 Додаток E. Негативні результати зворотного штриху. 135 Додаток F. Вирівнювання послідовностей зразків чищення та біопсії шийки матки. 136 15

prb: Білок ретинобластоми RCS: від абревіатури англійською мовою [Система швидкого захоплення] мРНК: Messenger Ribonucleic Acid RLB: від абревіатури англійською мовою [Reverse Line Blot] HSV: Вірус простого герпесу HSV-2: Вірус простого герпесу тип 2 ВІЛ: Вірус імунодефіциту людини ВПЛ: Вірус папіломи людини HPV-RA: Вірус папіломи людини високого ризику ВПЛ-BR: Вірус папіломи людини низького ризику 17

CIN II: Вважається повноцінним сквамозним інтраепітеліальним ураженням. Обмежений до базальних двох третин епітелію шийки матки. CIN III: При цьому типі пошкодження, який також вважається високим ступенем, дисплазія важка і охоплює більше двох третин епітелію шийки матки. У деяких випадках включаючи всю товщу слизової оболонки шийки матки. PCR-L1: ланцюгова реакція полімерази, що дозволяє ампліфікувати фрагмент приблизно 150 bp гена HPV L1, використовуючи праймери GP5 +/GP6 +. ПОШИРЕНІСТЬ: Це кількість випадків захворювання чи події в популяції та в певний час. БЛОТ РЕВЕРСНОЇ ЛІНІЇ: Це аналіз, заснований на зворотній гібридизації, який дозволяє ідентифікувати 37 генотипів ВПЛ за допомогою системи міні-блоттера та гібридизаційної мембрани після ампліфікації зразків методом ПЛР +. ВПЛ-РА: вірус папіломи людини високого онкогенного ризику, пов’язаний з розвитком інвазивних аногенітальних карцином. BR-HPV: Вірус папіломи людини з низьким онкогенним ризиком, пов’язаний з доброякісними ураженнями-бородавками та кондиломами. двадцять

що дозволяє охарактеризувати популяцію з ризиком зараження ВПЛ та подальший розвиток CCU. CCU передбачає високий поведінковий компонент кожної постраждалої популяції, тому важливо проаналізувати деякі задокументовані фактори ризику для інших груп населення та підтвердити їх вплив на конкретну досліджувану популяцію. Аналіз цих змінних та їх вплив є надзвичайно важливим для розуміння мережі причинно-наслідкового зв'язку та потенційного прогресування до злоякісної пухлини. У цьому контексті в цьому дослідженні було оцінено молекулярну методологію, засновану на адаптації RLB, яка складалася з послідовності PCRL1 +, з метою отримання інформації про зараження ВПЛ, генотипи, пов’язані з ураженнями CCU, та взаємозв’язок деяких факторів ризику, таких як використання оральних контрацептивів, кількість статевих партнерів, вік та супутнє зараження іншими мікроорганізмами для того, щоб зрозуміти їх динаміку у досліджуваній популяції. 25

1. ЗАДАЧІ 1.1 ЗАГАЛЬНА ЦІЛ Проаналізувати взаємозв'язок між типом ВПЛ, соціодемографічними, гінеколого-акушерськими, клінічними характеристиками та ураженнями раку шийки матки у популяції жінок у муніципалітеті Пасто. 1.2 СПЕЦИФІЧНІ ЦІЛІ Провести виявлення та молекулярний типізацію ВПЛ у жінок з муніципалітету Пасто. Визначити взаємозв’язок вірусного типу та деяких соціодемографічних, гінеколого-акушерських та клінічних характеристик при ВПЛ-інфекції та ураженнях при раку шийки матки. 26

Малюнок 5. Плоскоклітинна атипія (ASC-US). Клітина з ядром зросла у два з половиною рази більше свого нормального розміру, але без зміцнення ядерної мембрани. Джерело: Alonso et al., 2005. 45

3. МЕТОДОЛОГІЯ 3.1 Опис досліджуваної сукупності Це дослідження проводилось протягом двох років, в якому жінки без цитологічних відхилень, які погодились брати участь у дослідженні шляхом підписання інформованої згоди, які відповідали критеріям включення, належать до Соціальне підприємство штату Pasto Salud-ESE. Для включення цих зразків з 23 ІПС, що належать Pasto Salud ESE, було випадковим чином обрано 8 ІПС, розподілених у чотирьох областях: північ, південь, схід та захід муніципалітету Пасто. Зразок для лабораторного аналізу складався із залишку шийки матки (свіжий зразок). Відбір популяції жінок з цитологічними відхиленнями проводився шляхом вичерпного огляду всіх звітів про патологію протягом 24 місяців до грудня 2013 року. Було включено 32 біопсії жінок, які відповідали критеріям включення, від де Пасто та діагноз: деякий ступінь відхилення від норми LIEBG та LIEAG для CCU в асоційованих патологоанатомах LTDA. Малюнок 6. Карта муніципалітету Пасто, де розташовані місця включення зразків. Джерело: Google Earth. 46

4.2 Результати виявлення та молекулярного типізації ВПЛ 4.2.1 Аналіз якості зразків шляхом ампліфікації фрагмента гена β-глобіну для всієї досліджуваної сукупності. З 160 зразків для чищення шийки матки 152 виявили позитивний результат на ген β-глобіну і вважалися придатними для типізації за допомогою RLB та PCR-L1 GP5 +/GP6 +, результати цього скринінгу показані на малюнку 9. Рисунок 9. Ампліфікація гена β-глобіну у зразках для чищення шийки матки. Рядок 1: Маркер розміру молекулярного розміру ДНК GeneRuler ультра низького діапазону (10-300 bp), рядок 2: порожній (надмірно чиста вода), рядки 3-25: ПЛР/HHB Підсилюється з зразків шийки матки UDN183-UDN205. Джерело: Це дослідження. При аналізі якості 32 біопсій ген β-глобіну ампліфікували з клітинного лізату у всіх зразках, і їх розглядали для типізації. Результати цього скринінгу показані на малюнку 10. 73

Рисунок 11. Аналіз оптимізації Mg ++. Рядок 1: маркер молекулярного розміру ДНК драбини GeneRuler ультра низького діапазону (50-1000 п.н.), рядки: 2-6: Посилений від ВПЛ 33 при різних кількостях і концентраціях Mg ++ рядок 7: Порожній (надчиста вода). Джерело: Це дослідження. Отже, оптимізація концентрації MgCl2 та регулювання в реакційній суміші PCR-L1 GP5 +/GP6 + дозволили виявити зараження ВПЛ із клітинного лізату у 1,4% (2/143) жінок з цитологією (-), у 11,1 (1)/9) жінок із АСКС та у 34,4% (11/32) жінок із ЛІЕБГ, ЛІАГ та ККУ, загалом для 14 зразків ВПЛ +. Відповідні результати представлені на малюнку 12. Рисунок 12. Ампліфікація гена ВПЛ L1. Рядок 1: Маркер молекулярного розміру HyperLadderTM 100bp Bioline (100bp-1013bp), рядок 2: Бланк (надчиста вода), лінії 3-16 ПЛР/L1, продукти, рядки 3, 9 та 12 зразки ВПЛ + (UDN217: HPV 16, UDN 331: ВПЛ не визначено та UDN 338: ВПЛ 58), рядки 15 та 16: Посилений позитивний контроль ВПЛ 11 та ВПЛ 33. Джерело: Це дослідження. 77

4.3 Аналіз зв'язку між інфекцією ВПЛ, характеристиками популяції та ураженнями в ЦКУ 4.3.1 Характеристики популяції жінок з цитологією (-), АСКУС та ВПЛ-інфекцією 4.3.1.1 Соціодемографічні характеристики та інфекція ВПЛ. Аналіз цієї популяції за допомогою критерію хі-квадрат, проведений між ВПЛ-інфекцією та соціодемографічними, гінеколого-акушерськими та клінічними характеристиками, показав, що немає статистично значущої взаємозв'язку з рівнем значущості pe 4 7> 1 р-значення 0,577 0,325 0,900 K * a, b, c, d, e: коди вікових діапазонів. * C (-): Негативна цитологія. # М: Кількість зразків; ВПЛ +: позитивні зразки на зараження ВПЛ. Джерело: Це дослідження. 87

При молекулярному виявленні ВПЛ індекс Каппа продемонстрував відповідність між цитологією та ПЛР-L1/секвенуванням, остання дозволила виявлення та типізацію ВПЛ-RA 16, 58 та 33, тоді як цитологія дозволяла виявляти аномалії лише без ідентифікації ВПЛ типу. 103

РЕКОМЕНДАЦІЇ Необхідно продовжувати перевірку методології, використаної в цьому дослідженні, щоб знати справжню придатність, чутливість, надійність, відтворюваність та економічну ефективність щодо інших комерційно доступних методологій типізації ВПЛ. Бажано проводити спостереження за цитологічними жінками (-), ASCUS (+) та ВПЛ (+), щоб мотивувати медичних працівників вчасно вжити заходів та таким чином мінімізувати появу нових випадків CCU. У майбутніх дослідженнях доцільно включити методології, які оцінюють наявність таких генів, як E6 та E7, оскільки вони дозволять виявляти інфекцію ВПЛ у зразках з CCU та оцінювати вірусне навантаження, ініціювання статевого акту та інші фактори, про які повідомляється в генезис ККУ. 104

Серед очікуваних результатів: інформація про населення може бути проаналізована разом з молекулярною інформацією для пояснення зараження ВПЛ та її зв’язку з розвитком CCU, характеризувати популяцію групи ризику в муніципалітеті Пасто щодо зараження ВПЛ та подальший розвиток CCU, впровадження Молекулярна методологія виявлення ВПЛ та формування рекомендацій суб'єктам, що відповідають за спостереження та контроль за веденням пацієнтів, яким загрожує розвиток СКУ в Пасто. * Якщо ви вирішите взяти участь у дослідженні, візьмуть зразок для чищення шийки матки. Для відбору зразків буде підготовлений належним чином персонал, а також використовуватимуться стерильні матеріали за умов біобезпеки, встановлених для даного типу процедур, щоб ризик зашкодити вашому здоров’ю був мінімальним. 128

ПИСЬМО ПРО ВІДМОВУ ЗГОДИ Підготували: Клаудія Санчес, Карен Суарес, Наталі Нікола та Мілена Герреро Ф. ПП: № 1 Page 4 Головний слідчий: Місце проведення дослідження: Ім'я учасника: Через цей канал я хочу повідомити свою рішення про відмову від цього розслідування з наступних причин: (необов’язково) Підпис учасника Дата Адреса Дата свідка Адреса Дата свідка Адреса 131

Додаток B. Формат клінічної історії профілактики раку 132

Додаток C. Формат результатів цитології 133

Додаток D. Аналіз оптимізації Mg ++ для ПЛР/L1 GP5 +/GP6 + Кількість реагенту (мкл) реакційних компонентів E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 Ультрачиста вода 8,75 8,75 8,75 8,75 8,75 Буфер (1X) 5 5 5 5 5 dntps (200 мкм) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 GP5 + (1 мкМ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 GP6 + (1 мкМ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 HPV 33 ДНК 1 1 1 1 1 Taq pol (1,25 U) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 MgCl2 (C) (1 мМ) (1,5 мм) (2,0 мм) (2,5 мм) (3,0 мм) Додаткова надчиста вода 3,5 мкл 3 мкл 2,5 мкл 2 мкл 1,5 мкл E = аналіз оптимізації MgCl2. (C) = Концентрація 134

Додаток Е. Негативні результати зворотного штриху. Колонка 2 контролю HPV 33, стовпці 3-40, зразки чищення шийки матки, колонка 41 контроль HPV 33.135