реферат
Кілька генів тирозинкінази беруть участь у хромосомних транслокаціях при хронічних мієлопроліферативних розладах, але в деяких випадках все ще існують нестандартизовані транслокації. Ми повідомляємо про два таких випадки, що відповідають атиповому хронічному мієлоїдному лейкозу з транслокацією (8; 9) (p22; p24). Шляхом флуоресценції in situ гібридизації (FISH) на відповідних метафазах з бактеріальним штучним хромосомним зондом, що включає ген янус-кінази 2 (JAK2) при 9р24, ми спостерігали розподіл у обох пацієнтів, вказуючи на те, що цей ген був переставлений. Локус 8p22 містить різні гени-кандидати, включаючи ген перицентриолярного матеріалу 1 (PCM1), який вже бере участь у взаємних транслокаціях. Перегрупування гена PCM1 було продемонстровано FISH у обох пацієнтів. RT-PCR підтвердила злиття 3 ′ частини JAK2 з 5 ′ частиною PCM1. Аналіз послідовності химерної мРНК PCM1-JAK2 показує, що передбачуваний білок має домени спіралі PCM1 та домени тирозинкінази JAK2. Ця нова транслокація визначає JAK2 як потенційну терапевтичну мішень для сполук з активністю антитирозинкінази.
Головний
З хронічних мієлопроліферативних розладів хронічний мієлоїдний лейкоз є парадигмою, оскільки він пов’язаний із взаємною транслокацією за участю гена тирозинкінази Абельсона (ABL) (Heisterkamp et al., 1983). Транслокація t (9; 22) (q34; q11) утворює злитий білок BCR-ABL з активністю тирозинкінази, який може блокуватися невеликою сполукою, іматиніб-мезилатом (STI571) (Druker et al., 2001). У деяких пацієнтів з клінічними характеристиками ХМЛ (атипова ХМЛ) включаються інші гени, що кодують тирозинкінази, такі як PDGFRA (Baxter et al., 2002; Trempat et al., 2003) та PDGFRB (Baxter et al., 2003).
У цьому дослідженні ми повідомляємо про два випадки атипової ХМЛ з однаковою транслокацією t (8; 9) (p22; p24). Один із генів-кандидатів, що бере участь у цій новій транслокації, з великою часткою ймовірності належить до групи генів, що кодують білки з активністю тирозинкінази. Ген janus kinase 2 (JAK2) є хорошим кандидатом, оскільки він знаходиться на рівні 9p24. Насправді JAK2 був описаний у кількох випадках T-ALL (Lacronique et al., 1997), B-ALL та атипових ХМЛ (Peeters et al., 1997), в яких він злитий з TEL/ETV6. Крім того, кілька груп (Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Levine et al., 2005) повідомили, що єдина набута активуюча мутація JAK2 (Val617Phe) спостерігалася у більшості пацієнтів з поліцитемією вірусом, есенціальною тромбоцитемією та ідіопатичний мієлофіброз, підкреслюючи роль цієї кінази в мієлопроліферативних захворюваннях.
Обстеження, які ми проводили, базувались на припущенні, що ген JAK2 перебудований в пухлинних клітинах двох пацієнтів. Вони дозволили нам охарактеризувати нову взаємну транслокацію з синтезом PCM1 при 8p22 з JAK2 при 9p24.
Пацієнт 1, 46-річний чоловік, був госпіталізований у січні 1998 р. Через астенію, втрату ваги та порушення крові. Під час фізикального огляду у пацієнта спостерігалася блідість шкіри, але не спостерігалося ознак збільшення печінки або селезінки. Лабораторні результати показали анемію (гемоглобін = 11,9 г/дл), гіперлейкоцитоз (лейкоцити = 11,8 × 10 9/л) та нормальні тромбоцити. Підрахунок лейкоцитів показав 28% незрілих гранулоцитів, 2% еритробластів, але гіпереозинофілії немає. Мазки кісткового мозку та біопсія трефіну підтвердили гіперплазію кісткового мозку з мієлофіброзом, але без мієлодисплазії. Хромосомний аналіз клітин кісткового мозку показав ізольовану транслокацію t (8; 9) (p22; p24) без філадельфійської хромосоми. Остаточним діагнозом була атипова ХМЛ. Пацієнт отримував лікування Hydrea та отримав алогенну трансплантацію кісткового мозку у серпні 1998 року. Через 1 місяць він вилікувався від кровотворення, але в січні 1999 року помер від інфекційної пневмонії, пов’язаної з гемофагоцитарним синдромом.
Пацієнт 2, 44-річний чоловік, потрапив до лікарні в листопаді 2004 року після одномісячної історії правої надключичної маси з паралічем руки та анестезією підборіддя (V-черепно-мозковий нерв). У той час кількість клітин крові виявляло гіперлейкоцитоз (лейкоцити = 45, 8 × 10 9/л) з 21% еозинофілів, 30% незрілих гранулоцитів, 4% бластів та 1% еритробластів. Аспірація кісткового мозку була гіперклітинною і піддавала впливу 54% пероксидазно-позитивних мієлобластів та 24% еозинофілів. Ознак мієлодисплазії не спостерігалося. Був поставлений діагноз AML M2 з еозинофілією, розроблений в умовах атипової ХМЛ. Хромосомний аналіз виявив аномальний каріотип із ізольованою транслокацією t (8; 9) (p22; p24). Пацієнта лікували комбінованою хіміотерапією, що включала ідарубіцин та арацитин, пов’язані з мозковою профілактикою. Через місяць він досяг повної ремісії. Лікування було припинено променевою терапією до твердої речовини, діагностованої при вході.
Різні зонди FISH, специфічні для ABL та FGFR1 (8p11), були протестовані та підтвердили відсутність перебудови цих генів у двох випадках (дані не наведені). Тому ми шукали наявність генів-кандидатів для 8p22 та 9p24. Дослідження множинних генів, про які повідомляється для 9р24, сильно показало, що брав участь JAK2, що кодує тирозинкіназу. Крім того, JAK2 був описаний у (9; 12) (p24; p13) у кількох випадках гострого лімфобластного лейкозу та хронічних мієлопроліферативних розладів (Lacronique et al., 1997; Peeters et al., 1997). З цих причин ми тестували метафазні хромосоми, використовуючи FISH, з відповідним зондом BAK2 JAK2 (RP11-927H16), міченим з нік-трансляцією біотином, як описано раніше (Trempat et al., 2003). В обох випадках був записаний розділений сигнал: одна частина на хромосомі 9p24, а інша частина на 8p22 (рис. 1, 1а).
Аналіз FISH: Флуоресценція in situ гібридизація з зондом JAK2 (BAC RP11-927H16) та міченим біотином та дигоксигеніном зондом PCM1 (BAC RP11-484L21) відповідно, використовуючи набір для перекладу псевдонімів (Amersham pharmacia biotech) відповідно до інструкцій виробника. Пацієнт 1: (1a) FISH із зондом JAK2 (Baxter et al.), Сигнал розподілений між похідними хромосомами 9 та 8 (стрілки). (1b) FISH із зондами JAK2 (зелений) та PCM1 (червоний), ці два сигнали розділені (стрілки: сигнали злиття на похідних хромосомах 8 та 9). Пацієнт 2: метафаза (2a) та відповідна FISH (2b) із зондами JAK2 (зелений) та PCM1 (червоний), ці два сигнали розділені (стрілки: сигнали синтезу). Інші сигнали відповідають нетранслокованим хромосомам 8 і 9. JAK2 і PCM1 переставляються в цих двох випадках.
Повнорозмірне зображення
Дивлячись на локус 8p22, найкращим кандидатом було продемонстровано ген перицентриолярного матеріалу 1 (PCM1), який раніше був описаний у взаємній транслокації, що генерує ген злиття з RET при 10q11 (Corvi et al., 2000). Тому ми розробили набори праймерів в межах 3 'кодуючих послідовностей JAK2 (що відповідає домену ТЗ) та в 5' кодуючій області PCM1 та сформулювали RT-PCR аналіз загальної РНК з пухлинних клітин обох пацієнтів. Продукт розміром 4 кб отримували за допомогою РНК пацієнта 1 (рис. 2). Після секвенування цей продукт відповідав передбачуваній мРНК 9401 bp. Структура відкритого кадру читання химерної стенограми PCM1-JAK2 показала, що екзон 37 PCM1 (NM_006197) знаходився в кадрі з екзоном 9 JAK2 (NM_004972). Ця структура демонструє збереження всіх доменів спіральної спіралі PCM1 та домену тирозинкінази JAK2 (рис. 3). Зворотну розшифровку JAK2-PCM1 можна було виявити за допомогою відповідних праймерів (рис. 2). Продукт ПЛР приблизно 700 bp був отриманий в результаті 2363 bp злиття у кадрі. Через значну деградацію РНК, RT-PCR у пацієнта 2 залишалася безуспішною. Однак злиття PCM1 з JAK2 було підтверджено FISH у обох пацієнтів (малюнки 1b, 2a, b).
RT-PCR-аналіз химерної транскрипту PCM1-JAK2: Загальну РНК екстрагували методом Trizol (Gibco-BRL) і реверсували транскрипцію, використовуючи комплект ампліфікації кДНК Marathon (BD Biosciences). ПЛР проводили з BD, переважно з 2 ферментними системами ПЛР (BD Biosciences) згідно з інструкціями виробника. Продукт 4 kbp та продукт PCR 700 bp отримували за допомогою праймерів PcmF/JakK та JakC/PcmO (див. Послідовності нижче). Кожну реакцію ПЛР запускали із заготівлею, що відповідає суміші ПЛР, без введення кДНК. Заготовка, показана на малюнку, відповідає негативному контролю реакції PCR PCM1-JAK2. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для очищення ПЛР QIAquick (Qiagen). Внутрішній праймер JakF був використаний для послідовного встановлення точки розриву між PCM1 та JAK2 за допомогою набору ABI Prism Dye Terminator (Perkin-Elmer Applied Biosystem). PcmF IndexTerm 5′-TACAGCTGTCAGCTGCTAGTGTGGG-3 ′; PcmO IndexTerm 5′-TGGGCTCCCACCGTTTCACCTTCTT-3 ′; JakK IndexTerm 5′-CATCTGGGCATCCATCTGGTCTTGG-3 ′; JakF IndexTerm 5′-CTCGTCTCCACAGACACATACTCCAT-3 ′; JakC IndexTerm 5′-ACTGGAAACGGTGGAATTCAGTGGTC-3 ′
Повнорозмірне зображення
Послідовність нової транскрипції синтезу:( a ) Відкрита рамка зчитування химерного гена PCM1-JAK2. ( b ) Структура мРНК PCM1, PCM1-JAK2 та JAK2. CCD, домен котушки з котушкою; JH2, домен гомології/псевдокінази JAK JAK2; PTK, протеїн-тирозинкіназа
Повнорозмірне зображення
У нашому дослідженні геном-партнером JAK2 є PCM1, який кодує білок 228 кД, що містить кілька потенційних доменів спіральної спіралі у своїй аміно-кінцевій частині (Balczon et al., 1994). Цей білок знаходиться в цитоплазматичних гранулах, які називаються центріолярними супутниками. Експерименти, спрямовані на блокування активності PCM1 або з антитілами проти PCM1, або з малими інтерферуючими РНК, призводять до невпорядкованого збирання центросомних білків та організації мікротрубочок, що дозволяє припустити, що PCM1 відіграє ключову роль у цих процесах (Dammermann et al., 2004), особливо в клітинному циклі прогресування (Balczon et al., 2002). Ген PCM1 відповідає хромосомній області, яка часто втрачається при раку (Emi et al., 1992; Bhattacharya et al., 2003), але його роль у транслокації t (8; 10) (p22; q11) в сосочку стравоходу щитовидної залози рак привернув нашу увагу до можливих наслідків для химерних білків, таких як PCM1-RET. Крім того, в останньому випадку його партнером є рецептор з активністю тирозинкінази (Corvi et al., 2000).
Оскільки існує відносна повсюдна експресія PCM1, ймовірно, що промотор PCM1 пригнічує експресію злитого гена PCM1-JAK2, в якому карбоксильний кінець відповідає каталітичній активності JAK2. Через наявність мультизв’язуючих доменів в аміно-кінцевій частині PCM1, можливо, що химера PCM1-JAK2 зазнає олігомеризації, що призводить до активації домену тирозинкінази JAK2. Потрібні подальші експерименти in vitro, щоб підтвердити, що шляхи JAK/STAT та PI3′-кінази/AKT конститутивно активуються у відповідь на автофосфорилювання PCM1-JAK2.
Тут ми описали два випадки нового варіанту транслокації, що включає гени PCM1 та JAK2. Ідентифікація цих двох генів-партнерів допомогла б далі характеризувати нові випадки мієлопроліферативних розладів з такою транслокацією та контролювати залишкові захворювання після лікування. Клінічна картина у наших пацієнтів дещо відрізнялася, але обидва мали досвід атипової ХМЛ. Однак одному пацієнту поставили діагноз у хронічній фазі без гіпереозинофілії, тоді як у іншого обстежили у гострій фазі (циркуляція незрілих клітин кісткового мозку з бластним кризом та гіпереозинофілією).
У більш перспективній перспективі можна припустити, що JAK2 буде гарною мішенню для нових сполук з активністю антитирозинкінази.
Дякую
Ми вдячні доктору Сторлацці, Міланському університету, та доктору Максу Шаффане, INSERM U119, Марсель, за щедрий подарунок BAC JAK2 (RP11-927H16) та PCM1 (RP11-484L21), відповідно. Особлива подяка Dr. Фаб'єн Меггетто та Жан-П'єр Жаффрезу, INSERM U563 CPTP, Тулуза, Франція, за критичне читання рукопису.
Гранти: Cancéropole Grand Sud Ouest, Ligue contre le Cancer, Comités du Gers et de la Haute Garonne
- Прес-релізи - Новий закон припиняє несправедливу практику торгівлі продуктами харчування -
- Хлопання відкривають новий спосіб боротьби з жиром - Health Cure 2021
- Вже зрозуміло, як повинен виглядати правильний помідор! Новий час
- Великодня неділя буде дощовою та вітряною! Новий час
- Похід Te Araroa - Нова Зеландія трохи інший