предметів
реферат
Кератиноцити та фібробласти взаємодіють через секрецію факторів росту та цитокіну 9. Під час загоєння рани фібробласти в руслі рани виділяють фактор росту кератиноцитів (KGF), який запускає проліферацію кератиноцитів, що сприяє реепітелізації 10. Крім того, екзогенна експресія KGF-1 в посікових ранах генетичних моделей діабетичних мишей покращила швидкість загоєння ран та епітелізацію 11. Встановлено, що проліферація епітеліальних клітин, індукована 12-O-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетатом (TPA), та місцеве запалення зменшуються за відсутності проліферуючого фібробласту 12. Коротше кажучи, фібробласти відіграють важливу роль у секреції факторів росту, необхідних для проліферації кератиноцитів під час процесу загоєння шкірних ранок.
Міграція клітин, адгезія, морфологія, секреція фактора росту, проліферація та інші важливі клітинні процеси регулюються актиновим цитоскелетом 13. Білок N-WASP (Neural-Wiskott Andrich Syndrome Syndrome Syndrome), який повсюдно експресується і, як було показано, є критичним регулятором ремоделювання цитоскелетного апарату актину через комплекс Arp2/3 14. Дефіцит N-WASP у фібробластах призводить до зниження адгезії клітин-ECM та збільшення рухливості клітин 15. N-WASP регулює утворення інвадоподії 16 у фібробластах, трансформованих Src 17, 18, і впливає на 19 або клатрин-залежний незалежний ендоцитоз 20. Крім того, було встановлено, що N-WASP відіграє вирішальну роль у регуляції РНК-полімерази-II-залежної транскрипції, обробці РНК та відновленні ДНК завдяки взаємодії з комплексом PSF-NonO 21. Встановлено, що експресія N-WASP нижча у клітинах раку молочної залози 22, тоді як висока експресія у гепатоцелюлярній карциномі 23 .
Миші з дефіцитом N-WASP мали відхилення у формуванні нервової трубки, диференціюванні серця та мезодермі і померли в стадії зародка E11.5 24, 25. Умовна відмова від експресії N-WASP в мозку миші призводить до важкої гідроцефалії та передчасної постнатальної смерті 26. N-WASP також має вирішальне значення для розвитку Т-клітин 27. Умовна абляція експресії N-WASP в кератиноцитах призводить до виразки, облисіння та вираженої епідермальної гіперпроліферації. Це перерване циклічне руху цибулини волосся було зумовлене посиленням сигналізації TGFβ 28 або зменшенням транскрипції, що залежить від Wnt 29. .
результат
Втрата експресії N-WASP у шкірних фібробластах спричинила гіперпроліферацію епідерми у старих мишей
( A ) Геномний ПЛР-аналіз делеції екзона 3 і 4 N-WASP у клітинах шкірних фібробластів, виділених від контрольних та мишей N-WASP FKO. ( B ) Вестерн-блот-аналіз експресії N-WASP шкірних клітин фібробластів від ізольованих мишей у віці 13 тижнів. (Примітка: ми досягли понад 80% чистої популяції фібробластів завдяки нашому методу виділення фібробластів шкіри миші, він також містить невелику популяцію інших типів клітин). ( C. ) H&E пофарбовані частини спинної шкіри мишей 13-тижневого та 1-річного віку. Кількісна оцінка епідермальної ( D ) та шкірний ( Е ) товщина контрольних та зрізів шкіри миші N-WASP FKO. Миші N-WASP FKO мають більше двох епідермальних шарів порівняно з контрольними мишами. ** Представляє стор
( A ) Розподіл E-кадгерину у контрольних та N-WASP FKO мишей був нормальним, але миші N-WASP FKO показали кілька шарів клітин епідерми. Червоний: DAPI ( B ) Епідермальна проліферація, виміряна за допомогою імунного забарвлення за допомогою PCNA парафінових дорсальних ділянок шкіри у контрольних мишей 13-тижневого та 1-річного віку та мишей F-N-WASP. Синій: DAPI ( C. ) Підвищення кількості PCNA-позитивних клітин/MF було виявлено шляхом кількісного визначення у мишей N-WASP FKO. * Представляє p мишей FKO. Миші N-WASP FKO демонстрували підвищену експресію PCNA в шкірі порівняно з контрольними мишами.
Повнорозмірне зображення
Миші N-WASP FKO не мають шкірної бар'єрної функції
Щоб проаналізувати функцію шкірного бар'єру, ми виділили частину шкіри від контрольних та мишей N-WASP FKO та інкубували з епідермісом жовтий Люцифер. Потім частину шкіри аналізували за допомогою гістологічного фарбування, щоб візуалізувати присутність люциферового жовтого за допомогою флуоресцентної мікроскопії. І в контролі, і в N-WASP FKO флуоресцентний барвник був обмежений зовнішнім шаром епідермісу, вказуючи на те, що у мишей N-WASP FKO (рис. 3А) не було очевидної помилки в шкірній бар'єрній функції епідермісу. Диференціацію кератиноцитів у N-WASP FKO та контрольних мишей аналізували за допомогою імунофлуоресцентного фарбування на ранні та кінцеві маркери диференціації (кератин 10, інволюкрин, трансглутаміназа). Істотних відмінностей у схемі фарбування маркерів диференціації не спостерігалося між контрольними та мишами N-WASP FKO, однак був більш товстий шар фарбування клітин кератину 10, інволюкрину та трансглутамінази. Це свідчить про те, що делеція N-WASP у клітинах шкірних фібробластів не змінює диференціацію клітин епідерми (рис. 3B).
( A ) Невеликі свіжоізольовані ділянки шкіри аналізували для тесту на проникнення жовтого кольору Люцифера. На бар’єрну функцію проникності не впливали миші N-WASP FKO. ( B ) 13-тижневу контрольну шкіру та шкіру миші N-WASP FKO фарбували маркерами ранньої (кератин 10, трансглутаміназа) та кінцевою (залученням) диференціації. Явних відмінностей у експресії маркерів диференціації, що спостерігалися між контрольними та мишами N-WASP FKO, не спостерігалося. Червоний: DAPI.
Повнорозмірне зображення
Індукована ТРА гіперпроліферативна відповідь
Для вивчення шкірної реакції в умовах стресу ми обробляли шкіру контрольних та мишей N-WASP FKO місцево ефіром 12-O-тетрадеканоїл-форбол-13-ацетату (TPA). Очікувалось, що одноразова обробка 6,5 нМ/50 мкл TPA протягом 24 годин на спинній шкірі призведе до значного потовщення епідермісу як контрольних, так і мишей N-WASP FKO порівняно з мишами, обробленими носієм (Рис. 4A, B) . Гістологічний аналіз зрізів шкіри, оброблених TPA, показав посилений гіперпроліферативний ефект на шкірі миші N-WASP FKO порівняно зі стандартними суб'єктами. (Рис. 4А), при супутньому збільшенні кількості PCNA-позитивних проліферуючих кератиноцитів у шкірі миші N-WASP FKO (рис. 4С). Жодних змін, виявлених у напруженій (обробленій TPA) шкірі миші N-WASP FKO, не було виявлено в місцях з'єднання клітин епідермальних клітин, оскільки локалізація та структура Е-кадгерину були порівнянні з обробленою TPA шкірою миші (рис. 4D). Таким чином, лікування TPA призвело до збільшення гіперпроліферації епідермальних клітин у мишей N-WASP FKO порівняно з контрольними мишами.
( A ) Гістологічний аналіз розчинника (ацетон) та TPA (24 години) спинної шкіри контрольних та мишей N-WASP FKO шляхом фарбування H&E. ( B ) Кількісне визначення товщини епідерми дорсальних мишей, оброблених ацетоном та ТРА. Шкіра мишей N-WASP FKO значно товща, ніж шкіра контрольних мишей після обробки ТРА. ( C. ) Імуноофарбовування шкіри мишей, оброблених ТРА, для аналізу PCNA-позитивних клітин. Шкіра мишей N-WASP FKO продемонструвала значно більшу кількість PCNA-позитивних епідермальних клітин у порівнянні зі шкірою контрольних мишей. ( D ) Аналіз з'єднання клітин-клітина за допомогою фарбування Е-кадгерином у мишей, оброблених ТРА.
Повнорозмірне зображення
Втрата експресії N-WASP в шкірних фібробластах призводить до швидшого закриття рани
Шкірні фібробласти відіграють важливу роль у загоєнні ран та відновленні тканин 30. Щоб визначити вплив дефіциту N-WASP у фібробластах шкіри на відновлення тканин, ми провели тест на загоєння ран на контрольних групах віком від 13 до 15 тижнів та на мишах N-WASP FKO. Мишей піддавали пораненням повної товщини, а пошкоджену ділянку мишей фотографували та кількісно визначали у зазначені моменти часу (рис. 5). Миші N-WASP FKO продемонстрували значно швидше закриття рани на 2, 5 та 7 день після пошкодження порівняно з контрольними мишами (рис. 5А, Б). Крім того, суттєво зменшений діаметр рани (показаний стрілками) спостерігався на 7 день у мишей N-WASP FKO (рис. 5C, D). Для характеристики фенотипу прискореного загоєння ран у мишей N-WASP FKO, фарбування PCNA проводили на зрізах шкіри на 7 день після травми. У мишей N-WASP FKO ми виявили значно більшу кількість PCNA-позитивних клітин як у шкірних, так і в епідермальних ділянках порівняно з контрольними мишами (рис. 5Е). Це свідчить про те, що збільшення швидкості проліферації шкірних/епідермальних клітин шкіри після пошкодження сприяє швидшому закриттю рани у мишей N-WASP FKO. .
Миші N-WASP FKO мають підвищений рівень фібробластів та колагену
Загоєння ран - це багатоетапний процес, що включає фазу запалення, фазу проліферації та фазу дозрівання 32. Щоб визначити, чи можуть відмінності запальних реакцій сприяти збільшенню загоєння ран у мишей N-WASP FKO, фарбування лімфоцитів (CD3/CD4) та нейтрофілів (антиген Ly-6G) у грануляційній тканині. Експресія N-WASP не суттєво змінила здатність пошкодженої тканини набувати нейтрофіли, але помірно збільшила рекрутування лімфоцитів (рис. S4A). Крім того, в базальних умовах шкіра контрольних і N-WASP FKO мишей мала дуже низький вміст імунних клітин (дані не наведені). Головною особливістю погано загоюються ран є стійка запальна реакція в місці пошкодження 33. Незважаючи на незначне збільшення інфільтрації імунних клітин у рани мишей N-WASP FKO, рана швидше закривалась, припускаючи, що запалення, швидше за все, не буде головним фактором швидшого загоєння ран у мишей N-WASP FKO.
Повнорозмірне зображення
Сигналізація TGFβ збільшена в шкірі миші N-WASP FKO
Більший вміст колагену в грануляційній тканині мишей N-WASP FKO вказував на можливість збільшення секреції фактора росту. Крім того, перехресні зв’язки між фібробластами і кератиноцитами відбуваються через виділяються фактори росту, які є важливими під час загоєння ран. Представники сімейства факторів росту фібробластів (FGF) мають широкий мітогенний спектр на додаток до FGF7/KGF, який є специфічним мітогеном для епітеліальних клітин 38. Аналіз експресії FGF7 показав збільшення забарвлення FGF7 у шкірі миші N-WASP FKO (рис. 6Е). Крім того, незначне збільшення прозапального цитокіну IL-1α спостерігалося в шкірі мишей N-WASP FKO (рис. S4B). Експресія N-WASP в кератиноцитах регулює сигналізацію TGFβ 28. На основі цієї інформації ми проаналізували передачу сигналів TGFβ, використовуючи шкірний лізат від контрольних мишей та мишей N-WASP FKO. Миші N-WASP FKO експресували більш високі рівні TGFβ-RII, Samd2/3, TAK1 та їх відповідні активовані форми (p-Samd2/3, pTGFβ-RII) (рис. 6F, S4C). Отримані нами результати свідчать про те, що видалення експресії N-WASP в шкірних фібробластах призводить до збільшення кількості фібробластів, що призводить до збільшення вмісту колагену та фактора росту/секреції цитокінів/посилення сигналізації TGFβ, що призводить до гіперпроліферації епідермії та швидшого загоєння ран у N-WASP F мишей.
обговорення
N-WASP, який є членом сімейства білків WASP, регулює полімеризацію актину, регулюючи активність комплексу Arp2/3 14. N-WASP експресується повсюдно, і миші-нокаути N-WASP були ембріональними летальними, що свідчить про те, що N-WASP є важливим геном під час розвитку мишей 24, 25. Виявлено, що нокаутовані ембріони N-WASP вижили на попередній стадії гаструляції та ініціювали органогенез, але загинули до ембріонального дня 12 із нервовими трубами та вадами серця 25. Таким чином, багато досліджень використовували систему P-Cre lox для генерування кондиціонованих мишей-нокаутів N-WASP для вивчення ролі N-WASP в різних тканинах. Умовна елімінація N-WASP у м’язах Myf5-cre та MyoD-cre призвела до постнатальної смерті 39. Подібним чином умовне вибивання N-WASP у мозку за допомогою Nestin-cre також призвело до постнатальної смерті, ймовірно, спричиненої гідроцефалією 26. Дві дослідницькі групи генерували умовних мишей-нокаутів, що експресують абляцію N-WASP у кератиноцитах, використовуючи K5-cre 28, 29, але дві групи повідомили про протилежну роль N-WASP у кератиноцитах. Лефервер та ін. показали, що відсутність експресії N-WASP в кератиноцитах спричиняє зниження росту кератиноцитів, тоді як Любимова та ін. показали, що дефіцит N-WASP призводить до епідермальної гіперпроліферації 28, 29 .
Ми виявили, що N-WASP у фібробластах відіграє вирішальну роль у адгезії клітини-ECM 15. Щоб охарактеризувати роль N-WASP у фібробластах у розвитку та підтримці шкіри, ми створили мишей з дефіцитом експресії N-WASP у фібробластах, використовуючи Fsp-cre як орієнтир. Миші з генотипом N-WASP fl/fl; Fsp-cre, N-WASP FKO народилися після генетики Менделя і не виявили відхилень протягом 1 року після зростання в лабораторії. Жодних фізичних відхилень або зниження статевої енергії у мишей N-WASP FKO не спостерігалося порівняно з контролем (дані не наведені).
Матеріали і методи
гістологія
Тест на загоєння ран
Контрольних мишей (n = 16) та самців мишей N-WASP FKO (n = 16) у віці від 13 до 15 тижнів знеболювали за допомогою кетаміну/ксилазину (90 мкг/10 мкг). Мишей голили на спині і чистили спиртом. Для кожної миші (розділеної принаймні 1 см неушкодженої шкіри) було зроблено дві круглі рани повної товщини (середній розмір 10 мм у діаметрі) двома щипцями та ножицями на спинній стороні, використовуючи щипці та ножиці на спинній стороні без пошкодження нижньої м’язи, як описано в 62, 63. Рани покривали оклюзійною пов’язкою (Tegaderm; 3M TM) для запобігання інфікуванню. Рани фотографували за допомогою шкали за допомогою цифрової камери в 0, 2, 5 та 7 дні після травми. Площу рани визначали за допомогою програмного забезпечення imageJ, а швидкість закриття рани визначали як відсоток від площі рани до початкового розміру рани. Біопсії шкіри для гістологічного дослідження проводили з кожної рани на 0 і 7 день після операції. Щоб зробити колаген видимим, частини шкіри фарбували трихромним массоном (кат. №: 25088A-F, Polysciences Inc).
TPA-індукована гіперпроліферація
Контрольних мишей у віці від 13 до 15 тижнів та мишей N-WASP FKO голили за 24 години до нанесення TPA (6,5 нМ/50 мкл у розчиннику (ацетоні)) на спинну шкіру. Мишей забивали через 24 години обробки ТРА; шкіру виділяли, фіксували у нічному середовищі у 4% параформальдегіду/PBS при 4 ° C і вкладали у парафін для гістологічних зрізів. Зрізи фарбували антитілами до гематоксиліну та еозину, PCNA та Е-кадгерину.
Тест на проникнення жовтого люцифера
Для тесту на проникнення жовтого Люцифера 1 мМ люциферного жовтого (дорсальна шкіра, епідермальна сторона) виливали на 1 см 2 шматка шкірної тканини (дорсальна шкіра, епідермальна сторона) із запобіжними заходами, оскільки барвник не міг пройти через шкіру. Після інкубації протягом 1 години при 37 ° C шкіру ретельно промивали PBS і нарізали шкіру. Кріосекції фарбували DAPI та аналізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Тест на скорочення колагенового гелю
Експеримент проводили, як описано вище, з деякими модифікаціями 64. Ембріональні клітини фібробластів мишей N-WASP WT та N-WASP KO підтримували в середовищі DMEM/10% FBS. MEF N-WASP WT та N-WASP KO були добрим подарунком від лабораторії Scott B Snapper 25. Ембріональні клітини фібробластів миші трипсинізували, підраховували та додавали 200 000 клітин до 0,5 мг/мл розчину колагену I Corning Rat Tail (Корнінг, США). Для нейтралізації суміші негайно додавали 1 мкМ NaOH. Всю суміш негайно переносили на 24-лункову тарілку. Гелю давали постояти в інкубаторі CO 2 при 37 ° C протягом 3 годин. Після затвердіння гелю додавали повний DMEM. З боку лунки відокремлювали твердий колагеновий гель. Додавали попередньо розведений TGFβ1 для досягнення кінцевої концентрації 4 нг/мл. Повне середовище оновлювали кожні 24 години з використанням повного DMEM, що містить TGFβ1. Зображення було зроблено та кількісно визначено за допомогою ImageJ кожні 24 години, починаючи з 0 годин. Зображення були зроблені шляхом розміщення 24-лункової пластини, що містить гель, над світловою коробкою з лінійкою поруч з гелем, як стандарт для калібрування розміру пікселів.
Статистичний аналіз
Для статистичного аналізу значущості проводили неспарений t-тест студента та р-значення