| В В | В |
Індивідуальні послуги
Журнал
- SciELO Analytics
- Google Scholar H5M5 ()
Стаття
- Іспанська (pdf)
- Стаття в XML
- Посилання на статті
Як цитувати цю статтю - SciELO Analytics
- Автоматичний переклад
- Надішліть статтю електронною поштою
Показники
- Цитується SciELO
Пов’язані посилання
- Подібне в SciELO
Поділіться
Журнал ветеринарних досліджень Перу
версія В надрукована ISSN 1609-9117
Преподобний investiga. ветеринар. Перу v.23В n.3В LimaВ СерпеньВ 2012
Використання полімеразної ланцюгової реакції для статевого життя південноамериканських верблюдів
Ваня Чорногорія V. 1, Ленін Матурано H. 1,2,3, Jane C. Wheeler 2, RaГєl Rosadio A. 1,2
Метою цього дослідження була розробка методики ПЛР для визначення статі верблюдів Південної Америки (CSA) з використанням послідовностей цинкового пальця білка (ZF) із зразків крові та калу, а також клітин ембріонів альпаки. Всього було використано 28 зразків крові альпаки, лами та вікуану, 20 зразків фекалій вікуа і гуанако та 22 ембріони альпаки, зібрані між 72 та 96 годинами посткопули. Зразки фекалій та ембріонів зберігались у 96% та 70% етанолі відповідно. ДНК витягували з крові та калу за допомогою комерційних наборів. Для вилучення ДНК із ембріонів альпаки використовували три методи (кип’ятіння, протеїназа К та фенол-хлороформ). Для аналізу ДНК були розроблені дві методики ПЛР: мультиплекс (для ДНК калу та крові) та гемінована ПЛР (для ДНК клітин ембріона). Мультиплексна ПЛР точно визначала стать у 100% зразків ДНК, витягнутих з крові, у 87,5% зразків, витягнутих зі свіжих калів, і у 50% зразків калу 4 років. Однак генемізовану ПЛР не вдалося оптимізувати.
Ключові слова: ДНК, ПЛР, секс, південноамериканські верблюди
ВСТУП
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Отримання зразків ДНК
Вилучення ДНК з крові
Вилучення ДНК зі стільцем
Вилучення ДНК із ембріонів
Кількісна оцінка ДНК
Концентрацію та ступінь чистоти ДНК, витягнутої з усіх зразків, визначали спектрофотометрією при 260 нм та 280 нм. Якість ДНК перевіряли електрофорезом на агарозному гелі.
Процес оптимізації в ДНК крові складався з ампліфікації сегментів різного розміру висококонсервативного гена ZF у ссавців з використанням трьох праймерів (Aasen і Medrano, 1990). Протоколи використовували праймери ZFX2 і ZFX4 для ампліфікації сегмента пари 250 базових точок (bp), присутніх на обох статевих хромосомах (ZFX і ZFY), і третій зворотний ZFY2, що використовується разом з праймером ZFX2, для посилення сегмента 130 п.н., присутній лише на Y-хромосомі (ZFY) (Чорногорія та ін., 2007).
Роздільна здатність ампліфікованих фрагментів
Продукти кожної ПЛР аналізували на 2% агарозному гелі в буферному розчині TBE 0,5X (Тріс, борна кислота, ЕДТА) в горизонтальній камері електрофорезу разом з маркером молекулярної маси, щоб визначити розмір. Приблизний розмір фрагментів . Продукти ПЛР фарбували бромідом етидію, візуалізували на трансілюмінаторі та фотографували на камеру Polaroid (DS 34).
Інтерпретація результатів
Тваринам, зразки яких показали лише ампліфікацію продукту ПЛР на 250 п.н. (ZFX-Y), діагностували як жінок, а тваринам, які показали два одночасних амплікони, один на 250 п.н. (ZFX-Y) і інший на 130 п.н. (ZFY), діагностували як самці.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
ДНК, витягнута з крові альпак і лам, мала високу концентрацію (45-201 нг/мкл) і хороший рівень чистоти (> 1,8 та мінімальну наявність деградації), що підтверджує подібні характеристики, про які повідомляють інші види (Chu et al., 2006). ДНК крові диких тварин також мала високу концентрацію (39-211 нг/мкл) і хорошу чистоту (> 1,8) (Таблиця 4).
Успішні ампліфікації окремих сегментів ZFX і ZFY в одиночній ПЛР, а також спільне виявлення сегментів ZFX і ZFY в множинних ПЛР детально описані в таблиці 5. Оптимальне посилення ZFY було досягнуто з використанням температури вирівнювання 52 ° C і концентрації Mg 1,6 мМ та бичачий сироватковий альбумін (BSA) 1,2 мкг/мкл, що дозволило посилити хороший продукт у зразках, що містять до 25 нг ДНК. Для оптимального посилення сегмента ZFX-Y потрібна була температура 64 ° C з концентрацією Mg 2,7 мМ та BSA 0,8 мкг/мкл, необхідна для отримання видимих продуктів у зразках з більш ніж 0,1 нг ДНК.
Умови, оцінені для оптимізації множинної ПЛР, визначили, що для оптичної ампліфікації обох сегментів необхідно використовувати такі умови: температура вирівнювання 53 ° C, 2,5 мМ Cl2Mg, 1% BSA, 1% формаміду, 50 пмоль праймера ZFX2, 12,5 пмоль ZFX4 та 25 пмоль ZFY2 (таблиця 5). За цих умов можна було отримати хороші продукти в концентрації ДНК до 20 нг.
ЦИТУВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Аасен Е, Медрано Ж.Ф. 1990. Ампліфікація генів ZFY та ZFX для ідентифікації статі у людей, великої рогатої худоби, овець та кіз. Біотехнологія 8: 1279-1281.
3. Chu J, Lin Y, Wu H. 2006. Застосовність неінвазивного відбору проб у популяційному генетичному дослідженні тайваньських макак (Macaca cyclopis). Тайванія 51: 258-265.
4. Deuter RS, Pietsch, Hertel S, Mгірлер О. 1995. Спосіб отримання ПЛР, що підходить для фекальної ДНК. Нуклеїнові кислоти Res 23: 3800-3801.
5. GarcГa-Muro E, MP Aznar, Rodellar C, Zaragoza P. 1996. Специфічні для статі ПЛР/RFLP у собачих локусах ZFY/ZFX. Anim Genet 28: 150-158.
7. Lemos DC, Lopes Ríos AF, Caetano LC, Lobo RB, Vila RA, Martelli L, Takeuchi PL, Ramos ES. 2005. Використання гена TSPY для статі великої рогатої худоби. Genet Mol Biol 28: 117-119.
9. Novoa C, Franco E, García W, Pezo D. 1999. Доза гонадотропіну (ЕКГ та ХГЧ), суперовуляція та отримання ембріонів в альпаках. Rev Inv Vet, Перу 10 (1): 48-53.
10. Nsubuga AM, Robbins MM, Roeder AD, Morin PA, Boesch SC, Vigilant L. 2004. Фактори, що впливають на кількість геномної ДНК, витягнутої з фекалій мавп, та ідентифікацію віяла вдосконалений простий спосіб зберігання. Mol Ecol 13: 2089-2094.
11. Ортега Дж., Франко М., Адамс Б.А., Ральс К, Мальдонадо Ж.Е. 2004. Надійний неінвазивний метод визначення статі у зникаючої лисиці Сан-Хоакін (Vulpes macrotes mutica) та інших канід. Conserv Genet 5: 715-718.
12. Phua A, Abdullah R, Mohamed Z. 2003. Метод визначення статі, заснований на ПЛР, для можливого застосування при відборі статі кози шляхом одночасної ампліфікації генів Sry та Aml-X. J Reprod Dev 49: 307-311.
13. Prithiviraj F, Melnick J. 2001. Молекулярний статевий акт евтеріанських ссавців. Мол Екол Примітки 1: 350-353.
14. Pilgrim KL, Mckeelvey KS, Riddle AE, Schwartz MK. 2005. Felid ідентифікація статі на основі неінвазивних генетичних зразків. Mol Ecol Примітки 5: 60-61.
15. Помп D, Хороший BA, Geiser RD, Corbin CJ, Conley AJ. 1995. Ідентифікація статі у ссавців з ланцюговою реакцією полімерази та її використання для вивчення впливу статі на діаметр свинячих ембріонів 10 або 11 днів. J Anim Sci 73: 1408-1415.
16. Thibier M, Nimbart M. 1995. Статевий контроль зародків великої рогатої худоби в полі. Теріогенологія 43: 71-80.
17. TNC Vidya, Roshan V, Aravazhagan C, Sukumar R. 2003. Застосування молекулярного статі до вільно вигульованих популяцій азіатських слонів (Elephas maximus) на півдні Індії. Curr Sci India 85: 1074-1077.
18. Villesen P, Fredsted T. 2006. Швидке та неінвазивне ПЛР-статеве життя приматів: мавп, мавп старого світу, мавп нового світу та Стрепсірріни. BMC Ecology 6: 8. [Інтернет]. Доступно за адресою: http://www.biomedcentral.com/1472-6785/6/8
19. Вассер С.К., Х'юстон К.С., Келер Г.М., Кадд Г.Г., Фейн Р. 1997. Методи застосування польових досліджень ДНК фекалій Урсидів. Mol Ecol 6: 1091-1097.
Факультет ветеринарної медицини
Av. Circunvalacián Cdra. 28 с/п - Сан-Борха
Графа 03-5137 - Ліма - Перу
Тел .: (511) 435-3348 розширення 236
Факс: (511) 6197000 розширення 5017