вплив

  • Резюме
  • Довіритель
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Догляд та утримання тварин.
  • Експеримент 1.
  • Експеримент 2.
  • Вимірювання вироблення грудного молока та споживання молока цуценят.
  • Вимірювання концентрації лептину в молоці.
  • Вимірювання концентрації лептину в сироватці крові у цуценят.
  • Компоненти туші (співвідношення жиру до білка).
  • Статистичний аналіз.
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Маса тіла матері.
  • Виробництво молока та концентрація лептину.
  • Лептин сироватки цуценя.
  • Вага цуценя та споживання молока.
  • Кореляційні дослідження.
  • Склад тіла цуценя у віці 25 днів.
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • Глосарій

Резюме

Неоптимальне середовище для розвитку програмує нащадків на проблеми метаболізму протягом усього життя. Ми оцінили вплив материнської дієти з низьким вмістом ізокалорійних білків під час вагітності та/або лактації на кількість молока та концентрацію лептину в післяпологові дні 7, 14 та 21. Контрольні матері їли 20% казеїну (C), а обмежені матері (R) 10% казеїну, щоб забезпечити чотири групи: CC, RR, CR та RC (перша буква вагітності та друга дієта під час лактації), щоб дозволити оцінити ефекти, що впливають на материнську діяльність дієта під час вагітності та годування груддю. Молочний лептин не був визначальним фактором лептину сироватки цуценят. Лептин сироватки цуценя не пригнічував апетит до молока в жодному постнатальному віці. Лептин сироватки цуценя не корелював з жировою тканиною цуценя. Нарешті, нормальне збільшення постнатального лептину в сироватці цуценят затримувалося через внутрішньоутробне недоїдання. Ці дані свідчать про те, що харчування плода змінює строки збільшення лептину новонароджених та може сприяти розвитку порушень апетиту та метаболізму в зрілому віці.

Довіритель

Епідеміологічні дослідження на людях (1) та експериментальних тваринах (2) показали, що неоптимальні середовища внутрішньоутробно та протягом раннього життя новонароджених порушують ріст та схиляють людей до проблем зі здоров’ям протягом усього життя. Вплив обмеження поживних речовин матері під час вагітності та/або лактації вивчали на багатьох різних моделях. Різноманітні фенотипи росту, ендокринної та серцево-судинної системи є наслідком обмеження поживних речовин у різних вікнах розвитку. Перинатальне недоїдання схиляє нащадків до ожиріння у дорослому віці через зміни під час розвитку центральних нейрональних шляхів, опосередкованих регуляторними механізмами, включаючи лептин (3). Швидке відновлення зростання після раннього обмеження росту збільшує ризик розвитку ожиріння та серцево-судинних захворювань у зрілому віці (4, 5).

Ми показали, що обмеження материнського білка у щурів під час вагітності або лактації змінює постнатальний ріст, апетитну поведінку та концентрацію лептину на 110 дні післяпологового віку (12). Ефекти програмування розвитку на потомство залежать від статі потомства та періоду впливу на недоїдання. Тейшейра та ін. показали зміни концентрації лептину під час лактації у цуценят, матері яких зазнали обмеження білка або енергії (13). На відміну від отриманих нами даних (12), концентрація лептину в сироватці після відлучення не змінювалася. Цю невідповідність можна пояснити різницею у розмірах посліду, що зберігається під час лактації в цих дослідженнях.

Мало уваги приділяється тому, як різні режими обмеження поживних речовин змінюють кількість та якість молока, доступного під час лактації. Опубліковано зв'язок між вагою потомства, зростанням потомства та концентрацією лептину в молоці (14). Однак у високих видів, де раннє постнатальне збільшення лептину відіграє вирішальну роль у дозріванні апетитивних центрів мозку, важливо визначити, чи є лептин, відповідальний за цю ключову функцію дозрівання, внутрішньоутробним або материнським.

Ми оцінили вплив годування дієтою з низьким вмістом ізокалорійного білка під час вагітності та/або лактації на кількість молока та концентрацію лептину молока, доступного для цуценят у PND 7, 14 та 21, щоб визначити, чи існує якась залежність між неонатальним Концентрація лептину в сироватці крові з молочним лептином та загальна концентрація лептину молока, що надаються цуценятам протягом життя новонароджених у щурів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Догляд та утримання тварин.

Усі процедури були схвалені Комітетом з етики експериментів на тваринах "Національного інституту медичних наук та харчування, Сальвадор Зубіран" (INCMNSZ), Мексика. Подробиці материнської дієти, виховання та управління чотирма групами нащадків були детально опубліковані (15). Підводячи підсумок, дамбами були незаймані самки щурів Wistar віком 11 ± 1 тиждень і вагою 240 ± 20 г, отримані від INCMNSZ. Самки щурів регулярно утримувались на велосипеді у лабораторії Purina Laboratory Chow 5001 та під контрольованим освітленням (світло вмикалося з 7:00 до 19:00 при 22-23 ° C).

Самки щурів спарювались протягом ночі з перевіреними самцями заводчиків, і день сперми у вагінальному мазку був визначений днем ​​зачаття, день 0. У дослідженні утримувались лише щури, які були вагітні протягом 5 днів після введення самця. . Вагітних щурів переводили в окремі клітини з метаболізмом і випадковим чином розподіляли до однієї з двох груп, яких годували або 20% казеїновою дієтою (дієта з контролем С), або ізокалорійною 10% казеїновою дієтою (обмежена дієта-R) (16). Їжа та вода були доступні за бажанням .

Їжа забезпечувалася у вигляді плоского печива, яке тримали за решіткою, крізь яку щури гризли їжу. На 20 день після зачаття вагітних щурів перевели в нормальні клітини за оптимальних умов для пологів, що відбулося в ранні години доби між 9 ранку. і опівдні 22 числа після концепції. День пологів вважався днем ​​0 післяпологового життя.

Вага матері, розмір посліду та вага потомства реєструвались при народженні. Аногенітальну відстань вимірювали штангенциркулями. Згідно з нашими опублікованими даними (12), стать оцінювали відповідно до того, чи була аногенітальна відстань меншою (для жінок) чи більшою (для чоловіків) 2,5 мм. Щоб забезпечити однорідність досліджуваних, було включено посліди більше 14 цуценят або менше 12 цуценят. Потомство з 12-14 дитинчат доводили до 12 дитинчат для кожної матері, підтримуючи співвідношення статей якомога ближче до 1: 1. Було встановлено чотири групи: КК, в яких матерів, які отримували контрольну дієту під час вагітності, продовжували годувати контрольна дієта під час лактації; RR, при якому матері, які отримували дієту з обмеженим доступом під час вагітності, продовжували отримувати обмежену дієту під час лактації; CR, при якому матері, які отримували контрольну дієту під час вагітності, отримували обмежену дієту під час лактації; та CR, при якому матері, які отримували обмежену дієту під час вагітності, отримували контрольну дієту під час лактації. Після відлучення від грудей (PND 21) усіх цуценят годували дієтою С.

Експеримент 1.

Двадцять дві матері/посліди: СК (n = 5: 5,6 ± 0,4 самців/підстилка, 6,4 ± 0,4 самки/підстилка), RR (n = 6: 5,5 ± 0,5 чоловіків/підстилка, 6,5 ± 0,5 жінок/підстилка), CR (n = 6: 5,3 ± 0,7 самців/підстилка, 6,7 ± 0,7 самок/підстилка) та CR (n = 5: 6,2 ± 0,2 чоловіків/підстилка, 5,8 ± 0,2 самки/підстилка) досліджували для виробництва грудного молока та щенят споживання молока. Випадково для визначення компонентів туші використовували двох дитинчат самців та двох самок на підстилку. Попередній аналіз відмінностей за статтю щенят не виявив жодної різниці, і тому всі дані були об’єднані.

Експеримент 2.

Вісімдесят матерів та плід, n = 5 для вікової групи, використовувались для вивчення концентрацій лептину в сироватці молока матері та цуценят. Випадково для визначення сироваткового лептину використовували двох цуценят чоловічої та двох жіночих статей/посліду за віком, за винятком потомства PND 2, у якому використовували всіх цуценят для кожної статі на послід (n = 4-8 цуценят/стать) та обстежених зразків У цьому віці в сироватковому лептині не виявлено різниці між статями, тому ми усереднили дані для чоловіків та жінок.

Вимірювання вироблення грудного молока та споживання молока цуценят.

О 7:00 ранку на PND 7, 14 і 21, дитинчат виймали з матерів протягом 4 год, протягом яких матері їли за бажанням, поки дитинчат не годували. Виводили інкубаторів на хвості постійним маркером. Дамби зважували на початку та в кінці 4-годинного періоду. Цуценят зважували індивідуально безпосередньо перед поверненням до матерів і знову через 1 год.

Як обговорювалося нижче, чудова кореляція між збільшенням ваги матері та дитинча була використана для обґрунтування наближення приросту ваги матері до виробництва молока. Відносне споживання молока розраховували на основі абсолютного споживання їжі/маси тіла цуценя.

Вимірювання концентрації лептину в молоці.

Молоко отримували при PND 7, 14 і 21. Цуценят виймали у матерів на 4 год, після чого матері отримували 0,8 U окситоцину (ip), а молоко зціджували через 15 хвилин. Зразки вихрово перемішували, аликвотували і заморожували при -20 ° C до аналізу. Зразки молока розморожували при температурі 37 ° C та інтенсивно струшували перед піпетуванням, щоб забезпечити однорідність зразків. Концентрацію лептину в молоці визначали за допомогою RIA з використанням комерційного набору щурів від Linco Research, Inc. з межею виявлення 0,5 нг/мл з використанням 100 мкл зразка. Зразки молока аналізували в двох примірниках.

Вимірювання концентрації лептину в сироватці крові у цуценят.

О 7:00 в ПНД 7, 14 і 21 дитинчат вилучили з матерів на 4 год, протягом яких дитинчата не годувались. Ми отримали всі зразки щурів, що голодували, щоб уникнути варіації лептину. 2-денні цуценята не голодували. Між 11:00 ранку та опівдні щенят швидко евтаназували обезголовленням за допомогою гільйотини гризунів (Thomas Scientific, NJ). Кров стовбура збирали в поліетиленові пробірки і давали їй згортатися при 4 ° С протягом 1 год. Зразки крові центрифугували при 1500 g протягом 15 хвилин при 4 ° C. Зразки сироватки зберігали при -20 ° C до аналізу. Концентрації лептину в цуценях у сироватці визначали за допомогою RIA, використовуючи комерційний набір щурів від Linco Research, Inc. Кожен зразок сироватки тестували у двох примірниках.

Компоненти туші (співвідношення жиру до білка).

У віці 25 днів щурів швидко вбивали, як описано вище, і тримали замороженими в невеликих поліетиленових пакетах до аналізу. Голова та шлунково-кишковий тракт були викинуті від цуценят і не були включені в аналіз. Після зважування (вологий вага) кожну тушку нарізали на невеликі шматочки, поміщали в тарований склянку і сушили при 60 ° С до постійної ваги. Втрачена вага вважається вагою води. Висушені трупи подрібнювали і брали аликвоти. Жир визначали гравіметрично, випаровуючи розчинник з аліквоти екстракту гексан-ізопропанолу методом Сокслета, а загальний азот методом Кельдаля (17).

Статистичний аналіз.

Дані тварин у посліді були усереднені, і аналіз проводився лише щодо кількості послідів. Усі дані представлені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення. Статистичний аналіз проводили ANOVA з подальшим тестом Тукі. Непарний t-тест також використовувався для порівняння чоловічих та жіночих даних. Визначення вироблення грудного молока, споживання молока для щенят, лептину сироватки щенят та матері та корекції маси тіла щенят розраховували за допомогою кореляції Пірсона. стор

Лептин сироватки цуценя. Середнє значення ± SEM, n = 5 послідів розлучених матерів. * Максимальне значення лептину в тій самій групі, р 0,05) або коли всі групи та різні дні були згруповані (r = 0,04, p = 0,7). Частка лептину в сироватці крові від лептину до молока для щенят була вищою в CR, ніж у CC у всіх віках (p

Споживання молока для цуценят як функція виробництва молока в (A) PND 7 (r = 0,14, p = 0,6), (B) 14 (r = 0,8, p

Лептин сироватки цуценя як функція споживання молока (A) CC (r = 0,3, p = 0,3), (B) RR (r = 0,003, p = 0,9), (C) CR (r = 0,1, p = 0,7), (D) RC (r = 0,5, p = 0,07) та (E) усі групи та дні (r = 0,3, p = 0,01). Середнє значення ± SEM, n = 5 послідів.

Повнорозмірне зображення

Існувала позитивна кореляція між абсолютним споживанням молока (г/год) та масою тіла цуценят (г) у групах CC, CR та CR у PND 7, 14 та 21 (p

Маса тіла цуценя (A) як функція абсолютного споживання молока: CC (r = 0,76, p = 0,001), RR (r = 0,28, p = 0,3), CR (r = 0,9, p

Склад тіла нащадків (співвідношення жиру до білка) у 25 фунтах стерлінгів чоловічої статі (чорна смужка) та самки (біла смужка). Середнє значення ± SEM, n = 5 послідів. p PND