Вплив взаємозв’язку фермент-субстрат на ферментативний гідроліз бичачої сироватки Alcalasa® 2.4L
Вплив взаємозв’язку фермент-субстрат на ферментативний гідроліз бичачої сироватки Alcalasa® 2.4L
Омар А. Фігероа 1
Сенді П. Пеньялоза 2
1 Інженерний факультет, кафедра агропромислового машинобудування, Університет де ла Гуахіра, км 5 Віа Майкао, Ріохача, Колумбія. (електронна адреса: [email protected])
2 Інженерний факультет, кафедра агропромислового машинобудування, Університет Популярний дель Сезар, Діагональ 21 No 29-56 Вальєдупар-Колумбія. (електронна адреса: [email protected]; [email protected])
3 Факультет фармацевтичних та харчових наук, кафедра харчових продуктів, Університет Антіокія, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Медельїн, Колумбія. (електронна адреса: [email protected])
Метою цього дослідження було проаналізувати антиоксидантну здатність (виміряну за допомогою FRAP та ABTS) та хелатоутворюючий потенціал заліза в часі за різних ферментних та субстратних умов. Ферментативний гідроліз порошкової бичачої сироватки проводили в періодичному реакторі ємністю 0,5 л із постійною температурою. Гідролізати з найбільшою активністю розділяли відповідно до їх молекулярних розмірів у співвідношенні> 100, 10-100, + є низьким. Збільшення ступеня гідролізу сприяє антиоксидантній активності, виміряній методом ABTS, а також хелатуючій активності заліза гідролізатів.
Ключові слова: ферментативний гідроліз; сироватка; алкалаза; білки; антиоксидантні пептиди
Основною метою цього дослідження було проаналізувати антиоксидантну здатність (виміряну за допомогою FRAP та ABTS) та хелатний потенціал заліза з часом при різних умовах ферменту та субстрату. Ферментативний гідроліз порошку бичачої сироватки проводили в періодичному реакторі ємністю 0,5 л і постійною температурою. Найактивніші гідролізати розділяли відповідно до їх молекулярних розмірів зі швидкістю> 100, 10-100, + катіони низькі при низьких субстратах. Збільшення ступеня гідролізу сприяє антиоксидантній активності, виміряній методом ABTS, і хелатируючій активності гідролізованих металів.
Ключові слова: ферментативний гідроліз; білки сироватки; алкалаза; білки; антиоксидантні пептиди
Різні дослідження встановили взаємозв'язок між біологічною активністю пептидів та їх молекулярною масою. Зокрема, пептидні фракції з молекулярною масою від 1 до 4 кДа були б найбільш цікавими для харчових та/або фармацевтичних цілей (Saidi et al., 2014). І ультра, і нанофільтрація - це технології, що використовуються з відносним успіхом для очищення пептидів з біоактивними ефектами від гідролізованих білків молока, сої та рослинних субстратів (De Castro and Sato, 2015). Реакція гідролізу ферментативного білка має велику складність, головним чином через: i) різноманітну і часто невідому природу субстратів (первинні та третинні структури різних білків), ii) утворення нових субстратів гідролізу в міру прогресування реакції, iii) вивільнення короткі пептиди та вільні амінокислоти, що викликають серйозні гальмування. iv) інактивація ферменту з часом (Valencia et al., 2015) та v) ефекти, пов'язані з різною реакційною здатністю зв'язків щодо використовуваного ферменту, а також їх доступність до певних реакційних місць (третинної структури та четвертинних білків) (Fernández and Riera, 2013).
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Далі описуються елементи, пов’язані з управлінням реакційними системами, використовуваними аналітичними методами та розробкою експериментів.
Система реакцій
Гідроліз проводили у скляному реакторі ємністю 0,5 л із водяною циркуляційною сорочкою для регулювання температури, підключеною до циркуляційної ванни з термостатичним регулятором MX07R-20 (Thomas Scientific, США ± 0,07 ° C). Для контролю рН та реєстрації температури реакції використовували комбінований скляний електрод із фіксованою меленою мембраною, підключений до автоматичного титратора Titrando 842 (Metrohm, Швейцарія), керованого комп'ютером (програмне забезпечення Tiamo 1.2.1), як показано 1. Реакційне середовище постійно перемішували за допомогою магнітної мішалки 801 (Metrohm, Швейцарія) зі швидкістю 400 об/хв. Температура та рН у системі підтримувались постійними зі значеннями 61 ° C та 9 відповідно.
Використовували пульверизовану сироватку з бичачого молока, придбану у комерційного постачальника в місті Богота-Колумбія, із заявленим вмістом білка 12%. Ці дані були підтверджені методом Кельдаля (AOAC 2005, 954.01), використовуючи 6.38 як коефіцієнт перетворення для оцінки вмісту білка. Фермент відповідає ендопротеазі Bacillus licheniformis з комерційного препарату Alcalasa ® 2,4 л (2,4 а.е./г) харчового сорту (Новозимес, Данія).
Рис. 1. Схема системи реакції гідролізу, використана в експерименті.
Процес гідролізу ферментів
Реакцію проводили за допомогою ферментативного гідролізу, контрольованого методом pH-stat, визнаного найбільш використовуваним у ферментативному гідролізі завдяки своїй простоті (Rutherfurd, 2010), що полягає у підтримці рН постійним шляхом додавання основи або розведеної кислоти. Для цього випадку, оскільки мова йде про лужну реакцію, використовували 1 М NaOH. В принципі, додана основа для підтримання постійного рН нейтралізує лише протони, що виділяються під час розщеплення амідної зв’язку білків і пептидів при лужному рН, який замінюються катіоном основи; таким чином, протони, що утворюються при гідролізі, еквівалентні молям доданої основи (Adler-Nissen, 1986). Оцінка GH була зроблена за допомогою рівняння (1).
Де: h = кількість гідролізованих пептидних зв'язків; Htot = Загальна кількість пептидних зв’язків у білковому субстраті (екв/кг); VNaOH = об'єм загального NaOH (L), Nb = нормальність основи, Mp = маса білка (у кг), GH = ступінь гідролізу.
Ступінь дисоціації груп α-NH2, що виділяються в реакції, α, обчислюється безпосередньо з рівняння (2) і залежить від робочого рН та рК. Остання істотно змінюється залежно від температури реакції і може бути оцінена згідно з рівнянням (3) (Salazar et al., 2012). Було використано розрахований α 0,992 і htot 8,8 мекв/г, що було повідомлено для сироваткових білків (Adler-Nissen, 1986).
Де: α = Ступінь дисоціації білка і Т = робоча температура в градусах Кельвіна.
Опис конструкції
В аналізі було підтверджено вплив E0 (150, 300 та 600 мг/л) та S0 (5,10, 10,20 та 20,40 г/л) через час реакції (0-120 хв) на антиоксидантну здатність in vitro (ABTS та FRAP) та хелатоутворююча здатність заліза (CQFe). Порівняльний аналіз еволюції різних залежних змінних був проведений у двох групах експериментів: A) змінюючи S0 і підтримуючи E0 постійним; Б) підтримання постійного значення S0 і варіювання E0, як зазначено в таблиці 1. Рівні концентрації субстрату збігаються з областю, близькою до значення Km, де початкова швидкість гідролізу значна, на кривій насичення. У той час як використовувані рівні ферментів були визначені попередніми неопублікованими тестами. В аналізі використовували ANOVA для повторних вимірювань з внутрішньопредметним фактором (час: 0, 10, 20,75 та 120 хв) та міжпредметним фактором (S0 або E0 для кожного експерименту), із статистичним рівнем значущості від 0,05. Кожен гідроліз в умовах, встановлених конструкцією, проводився у трьох примірниках.
Біоактивний потенціал гідролізату
Проби відбирали у зазначений час, що представляє різну ступінь гідролізу. Зразки піддавали 90 ° C протягом 10 хв для ферментативної дезактивації, а потім заморожували при -20 ° C для подальшого використання в аналізі in vitro оціненої антиоксидантної активності.
Таблиця 1: Умови роботи (рівні контрольних змінних та залежних змінних) для проведених експериментів: А) змінний субстрат та Б) змінний фермент.
Визначення антиоксидантної активності за допомогою ABTS
Це було здійснено за методом, описаним Re et al. (1999), в якому 100 мкл зразка або стандарту Trolox змішували з 1000 мкл розчину ABTS. Потім їх інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Поглинання реєстрували при 730 нм у спектрофотометрі Genesys ™ 10S UV-Vis UV-Vis (Thermo Scientific, США), використовуючи в якості стандарту розчин Trolox з концентрацією 0-200 мкМ. Результати виражали у мікромолях еквівалентів тролоксу на грам білка (мкмоль ET/г).
Визначення антиоксидантної активності FRAP
Це було визначено за методологією, описаною Pulido et al. (2000), 900 мкл реагенту FRAP (з TPTZ, FeCl3 та 3М ацетатним буфером) змішували з 90 мкл дистильованої води та 30 мкл зразка або стандарту Trolox та інкубували при 37 ° C у сухій ванні протягом 30 хв. Збільшення поглинання при 595 нм вимірювали за допомогою спектрофотометра Genesys ™ 10S UV-Vis (Thermo Scientific, США) проти буферної заготовки ацетату натрію. Як стандарт використовували розчин Trolox з концентрацією 0-300 мкМ. Результати виражаються у мікромольних еквівалентах тролоксу на грам білка (мкмоль ТЕ/г білка).
Хелатувальна активність заліза
Був використаний метод, описаний Decker and Welch (1990), з деякими модифікаціями. 1 мл зразка змішували з 20 мкл 2мМ розчину FeSO4 • 7H2O. Суміш перемішували і давали постояти протягом 5 хвилин. Додавали 40 мкл 5 мМ розчину феррозину та інтенсивно перемішували. Його чекали 10 хв, і поглинання зчитували при 562 нм. Відсоток хелатування розраховували згідно з рівнянням 4.
Очищення пептидних фракцій ультрацентрифугуванням (UF)
Гідролізати сироватки, які виявили найвищу антиоксидантну активність, концентрували ультрацентрифугуванням з використанням ультрафільтраційних пробірок Amicon Ultra-15 (Merck Millipore, Німеччина), з мембранами PLHK Ultracel-PL, об'ємом 15 мл і з скороченнями молекулярної маси 100, 10 і 3 кДа. Їх центрифугували при 5000 х g протягом 20 хв у модельній центрифузі U-320 (BOECO, Гамбург, Німеччина). Було отримано чотири фракції (> 100 кДа; 10-100 кДа; Рис. 2: Графічне зображення інверсів початкової швидкості при різних концентраціях субстратів (1-32 г/л) за даними Lineweaver-Burk.
Результати реєструють типову поведінку для системи насичення ферментів без доказів ефектів інгібування на субстрат у діапазонах оціненої концентрації, як показано на подвійному графіку взаємних реакцій Lineweaver-Burk (рис. 2). Для реакційної системи LSB-Alcalasa® 2,4 L було отримано значення Vmax, що дорівнює 0,00218 ммоль/хв, і значення Km 10,22 г/л, які були отримані зі значним коефіцієнтом детермінації (R 2 = 0,968).
Вплив ферменту та субстрату на антиоксидантний потенціал
Значення Km являє собою міру спорідненості між Alcalasa ® 2,4 л і субстратом; ця концентрація субстрату була взята в якості еталону для аналізу впливу концентрації ферменту на антиоксидантну активність (FRAP і ABTS) в різні періоди гідролізу (Exp B).
У таблиці 2 наведено значення р для різних статистичних тестів. У результатах багатовимірного аналізу чотири статистичні дані: слід Піллая, Лямбда Вілкса, слід Хотелінга та основний корінь Роя вказують на те, що фактор часу є значним (р 20%).
Таблиця 2: ANOVA повторних вимірювань у часі для експериментів зі змінним субстратом (Exp A) та змінним ферментом (Exp B), з ABTS та FRAP ємністю як відповіді.
Відомо, що гідроліз за допомогою Alcase 2,4 л сприяє антиоксидантній здатності білків. Як було засвідчено в численних дослідженнях, GH з часом збільшується, і таким же чином покращується антиоксидантна здатність (Bah et al., 2015). Це пояснюється тим, що антиоксидантна активність в основному приписується пептидам з низьким молекулярним розміром, і певним чином, ГР став узагальненим як непрямий інструмент для опису розподілу молекулярної маси гідролізатів, тоді як тривалий гідроліз є зайвим. Майже завжди у високих ступенях гідролізу і, отже, набагато менших розмірів пептидів (Morales et al., 2017). Результати узгоджуються з цим аналізом, однак, дані погоджуються, що ця антиоксидантна активність необов’язково однакова для фракцій з подібними ГР, досягнута при комбінаціях різних рівнів.
Антиоксидантна активність та ГР у реакціях із субстратом та різноманітними ферментами
З іншого боку, коли вносяться зміни у початковій концентрації робочого субстрату, можна зазначити, що антиоксидантна активність ABTS та FRAP має різну поведінку, як показано на малюнках 4 (А та В). У випадку ABTS, через 75 хв, µmolTE на грам білка (вище 800) виявляється без різниці між середнім та високим рівнем субстрату (рис. 4А). Тобто, операція з низькими концентраціями субстрату, незважаючи на те, що демонструє відносно більший розвиток GH з часом і навіть досягає більш високих кінцевих GH, не є задовільною для отримання пептидних фракцій зі здатністю нейтралізувати катіони ABTS +. Для випадку FRAP на фіг. 4B можна помітити, що всі гідролізати, досягнуті з найвищим рівнем субстрату та тими, що відповідають кінцевому часу, на середньому та низькому рівнях, були більше 400 мкмольТЕ на грам білка; задовільні значення, якщо врахувати, що метод не вимірює антиоксиданти, що містять групи SH, такі як деякі амінокислоти, оскільки вони не ефективно відновлюють Fe 3+ до Fe 2+ .
3: Антиоксидантна активність, виміряна за допомогою (A) ABTS та (B) FRAP в бичачій сироватці для різних концентрацій ферменту (E0) проти GH, при S0 10,22 г/л.
У дослідженнях Seo et al. (2015), здатність захоплювати вільні радикали з гідролізатів білків плазми крові пояснюється кількома механізмами: здатністю віддавати водень, стабілізувати радикали, секвеструвати прооксидаційні іони металів і, ймовірно, утворювати фізичний бар’єр навколо крапель жиру за допомогою певної амінокислоти . За даними Saiga et al. (2003), ця антиоксидантна здатність пов’язана з існуванням декількох амінокислот, таких як тирозин, триптофан, метіонін, лізин, гістидин та цистеїн; Однак не тільки присутності цих амінокислот може бути достатнім для прояву активності, але вони також впливають на первинну структуру пептидів та їх амінокислотну послідовність.
Рис. 4 Тенденція антиоксидантної активності, виміряна за (A) ABTS та (B) FRAP у бичачій сироватці для різних концентрацій субстрату (S0) проти GH, з E0 300 мг/л.
Бутре та ін. (2012), встановили, що для гідролізатів з однаковими ГР гідролізати 1% бичачої сироватки містять менше інтактного білка, ніж гідролізати, вироблені з більш високими концентраціями субстрату, оскільки спорідненість ферменту до білка визначається балансом між природним білком і що розгорнуто у вирішенні (Deng et al., 2018). Зміни цього балансу можуть свідчити про зміни в механізмах гідролізу. Показано, що спорідненість інтактного білка була різною при гідролізі з алкалазою до різних концентрацій субстрату, тобто склад цих гідролізатів був різним, і фактично це було спричинено змінами селективності ферменту в різних умовах операція (Butré et al., 2012). Це може пояснити, з одного боку, відмінності, виявлені в антиоксидантній активності, виміряній для різних ГР на різних рівнях субстрату.
Хелатувальна активність заліза
Рис. 5 Відсоток хелатування порівняно з% GH. Концентрація субстрату 10,22 г/л, використовуючи 300 мг/л ферменту
Концентрація антиоксидантних пептидних фракцій
Таблиця 3: Порівняння між групами фракцій, отриманих ультрафільтрацією після гідролізу з S0 = 10,22 г/л, та низьким та середнім рівнями ферменту, використаного в експерименті "B
У реакції ферментативного гідролізу LSB з алкалазою спостерігається значний вплив часу на антиоксидантний потенціал гідролізатів сироватки. Крім того, антиоксидантна активність вища при менших концентраціях ферментів. З різним рівнем ферменту збільшення ГР сприяє антиоксидантній активності, виміряній методом ABTS, а також хелатологічній активності металів гідролізатів. З іншого боку, при роботі цієї реакційної системи з низькими концентраціями субстрату, незважаючи на те, що з часом ефективніші показники GH, навіть досягаючи кінцевих GH порівняно вище, ніж ті, що отримуються з іншими рівнями субстрату, фракції пептидних сполук не мають великий потенціал у здатності нейтралізувати катіони ABTS +. У випадку активності, виміряної за допомогою FRAP, усі гідролізати, досягнуті з найвищим рівнем субстрату та тими, що відповідають кінцевим часом, на середньому та низькому рівнях, перевищували 400 мкмольТЕ на грам білка, що є задовільним.
AOAC = Асоціація офіційних аналітичних хіміків.
FRAP = антиоксидантна сила відновлення заліза.
ABTS = азинобіс 3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота.