предметів

реферат

Квіткові гомеотичні фактори транскрипції (TF) діють у поєднанні для визначення ідентичності органів, що цвітуть. Однак архітектура та функції генної регуляторної мережі (GRN), що регулює специфікацію квіткових органів, досі недостатньо вивчені. Зокрема, взаємозв'язок гомеотичних ТФ, мікроРНК (мікроРНК) та інших факторів, що контролюють ініціювання та ріст органів, систематично не досліджувався. Тут, використовуючи комбінацію даних про геномно широке зв’язування TF, дані мРНК та експресії мікроРНК, ми реконструюємо динамічний GRN, що регулює розвиток квіткових меристем та диференціацію органів. Ми ідентифікуємо переважаючі петлі (FFL), опосередковані квітковими гомеотичними ТФ та мікроРНК, які регулюють загальні мішені. Експериментальна перевірка когерентного FFL показує, що розмір вікна контролюється модулем miR319/TCP4, регульованим SEPALLATA3. Далі ми демонструємо, що комбінаторне зв’язування ДНК з гомеотичними факторами та окремими іншими ТФ є предиктором специфічних для органів закономірностей експресії генів. Наші результати дають цінний ресурс для вивчення молекулярних регуляторних процесів, які є основою для специфікації квіткових органів у рослин.

Ріст і диференціація квіткових органів додатково контролюється іншими типами ТФ, включаючи BELLRINGER (BLR) 22, JAGGED (JAG) 23, ETTIN (ETT) 24, 25 та REPRESSORA GIBBERELLIC ACID (RGA) 26. BLR кодує гомедомен TF і відіграє центральну роль у розвитку апікальної меристеми верхівкової активності, впливаючи на активність меристем, філотаксів та квіткових візерунків органів 22. JAG кодує цинково-пальцевий TF, який регулює утворення та ріст меж органів 27. ETT - це рецептор, що реагує на ауксин, який регулює кілька аспектів морфогенезу квітів 24, 25, а RGA контролює розвиток суцвіть за допомогою участі в сигнальному шляху гібереліну 26, 28 .

Імунопреципітація хроматину (ChIP) з подальшим високопродуктивним секвенуванням ДНК (ChIP-seq) полегшує ідентифікацію геномних областей, пов’язаних основними ТФ розвитку під час розвитку квітів29. Біологи почали розуміти закономірності зв'язування геномних TF 30, 31 та складних генних регуляторних мереж (GRN), які контролюють формування квітів у глобальному масштабі 32. Однак систематичного аналізу цільових генних мереж цих основних регуляторів все ще недостатньо, і тому наші знання про пов'язані з ними мережеві компоненти, які контролюють розвиток квіткових органів, є неповними. У зв'язку з цим поєднання даних про геномне зв'язування та експресію дає можливість уточнити нормативний "код", який лежить в основі специфікацій квітів.

Багато факторів, такі як мікроРНК (miРНК), відіграють роль у переході квітки та розвитку квітки. Наприклад, показано, що віковий перехід від вегетативного до репродуктивного росту регулюється MIR156, який поступово зменшується з віком, що призводить до посиленого вираження його цілей, TF SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), які в свою чергу є активатори вихідних генів. Ідентичності FM, LFY та AP1, а також MIR172 (посилання 33, 34, 35). MIR172 націлений на AP2 та його тісно пов'язані паралоги, тим самим контролюючи флористичний перехід та специфічну активацію квіткових гомеотичних генів 16, 36. Інші звіти показали, що MIR319 впливає на розмір пелюстки, регулюючи гени TCP4 і TCP10 37. MIR159, MIR160, MIR164, MIR165, MIR166 та MIR167 також відіграють роль у морфогенезі квіткових органів у Arabidopsis 38. Незважаючи на багато повідомлень про мікроРНК, які регулюють перехід квітки та розвиток квітки, все ще не вистачає повного розуміння динамічного контролю цих процесів мікроРНК. Зокрема, ми маємо обмежені знання про те, як самі мікроРНК регулюються вхідними регуляторами.

У цьому випадку ми провели інтегративний аналіз даних про зв'язування геномів у всьому геномі основних регуляторних ТФ, включаючи фактори, що контролюють перехід квітки (FLC, FLM, SVP та SOC1), TF FM/ідентичність органів (LFY, AP1, AP2, AP3, PI, SEP3, AG) та регулятори морфогенезу квіткових органів (BLR, JAG, ETT, RGA). У поєднанні з нещодавно створеними стадіон-специфічними даними мРНК та мікроРНК були побудовані та досліджені GRN, що контролюють репродуктивний ріст у Arabidopsis, з акцентом на дії мікроРНК у мережі. Ми інтегрували всю інформацію, пов’язану з TF, що регулюється miRNA, до мережевої регуляторної мережі. Ми провели мережевий аналіз для систематичного пошуку збагачених мережевих мотивів у цій "метамережі" та виявлення переважних зворотних петель, опосередкованих мікроРНК (FFL). Ми також підтвердили важливу роль FFL, який складається з MIR319a та його цільових показників TF в опосередкуванні росту пелюсток. Нарешті, ми продемонстрували, використовуючи метод машинного навчання, що комбінаторне зв'язування гомеотичними регуляторами та іншими ФТ із загальними генами-мішенями є важливим для фазової та орган-специфічної активації генної діяльності.

результат

Земля, що пов’язує ТФ під час розвитку квітки

мереж

Повнорозмірне зображення

Загалом, кількість сайтів зв'язування TF (TFBS; їх називають "піками") сильно різниться для різних регуляторів або для одного і того ж регулятора на різних стадіях (рис. 1в; додаткові дані 2). BLR, LFY та SEP3 демонструють найбільшу кількість сайтів зв'язування, що узгоджується з тим фактом, що ці ТФ відіграють різноманітну та різноманітну роль у репродуктивному розвитку 40, 41, 42. SEP3 набуває значних місць зв'язування на всіх етапах розвитку цвітіння, що відповідає його ролі під час розвитку квіткових органів та рівням його експресії (рис. 1в). З іншого боку, AP1 втрачає місця зв'язування під час періоду розвитку, що узгоджується з його важливою роллю як фактор ідентичності FM на ранніх стадіях розвитку квітки та більш обмеженою експресією у пізніші моменти часу (знижена ефективність ChIP).

Зайнятість декількох TF передбачає динаміку експресії генів

Коротко кажучи, гени, зв’язані множинними TF, демонструють більш динамічну експресію під час розвитку квітки. Різні типи регуляторних генів та визначений набір міРНК є одними з цільових генів-цілей у мережі розвитку квітів.

miRNA-опосередкований GRN та збагачені мережеві мотиви

Серед мішеней головних регуляторів квітки часто ідентифікували гени міРНК (рис. 1г) і часто зв’язувались множинними ТФ (рис. 2д). Враховуючи, що основна категорія мішеней мікроРНК для рослин складається з TF 48, і ці мішені також можуть безпосередньо регулюватися головними регуляторами квітів, привабливо з’ясувати GRN розвитку, які пов’язані з основними флористичними регуляторами TF, генами miRNA та їх цільовими генами. У такій "метамережі" може бути визначений вплив різних регуляторних механізмів, і мікроРНК, які діють як проміжні гравці, можуть забезпечити додаткові рівні надійності мережі 49. Насправді загалом існує 422 передбачувані регуляторні взаємозв’язки TF-miRNA та 273 посттранскрипційні взаємодії miRNA-TF між 15 основними регуляторами, 144 експресованими генами miRNA та 674 TF-генами, зміненими в експресії (рис. 3а). Аналіз структури мережі Silico показав, що видалення генів-концентраторів призводить до швидшої втрати взаємодій у мережі без регулювання мікроРНК порівняно з мережами, опосередкованими мікроРНК (рис. 3b). Це спостереження свідчить про те, що опосередкована мікроРНК регуляція підвищує топологічну стійкість 50 квіткових GRN.

Повнорозмірне зображення

Повнорозмірне зображення

Органоспецифічний GRN

Повнорозмірне зображення

обговорення

Морфогенез квітів - це надзвичайно надійний та стандартизований процес моделювання, що ініціюється поєднанням екологічних та ендогенних сигнальних шляхів. Хоча було добре вивчено, що основні регуляторні ФТ, які діють на різних стадіях процесу цвітіння, утворюють складні регулятивні петлі, їх регулятивна взаємодія набагато менш чітка. Зокрема, органоспецифічні GRN квіткових гомеотичних білків залишаються загадковими, оскільки лише невелика частина потенційних генів прямої мішені цих факторів була визначена як DE у розвитку квітів. Тут ми показали, що систематичне поєднання 15 даних TF-зв'язування ДНК з регуляторними ролями у розвитку квітів здатне передбачити гени, які динамічно регулюються під час морфогенезу квітки. Отриманий GRN збагачується регуляторами транскрипції та локусами мікроРНК. Структура мережі демонструє специфічне надмірне представлення добре вивченого мотиву FFL, яке опосередковується спільною активністю TF та miRNA.

Підводячи підсумок, систематична інтеграція даних, що зв’язують ДНК, з даними геномної мРНК та експресії мікроРНК дозволила нам визначити ключові регуляторні властивості GRN, які контролюють ранні стадії розвитку квітів, включаючи специфікації шкірки квітів та диференціацію та ріст органів. Ми також виявили новий FFL, який контролює ріст пелюсток за квітковими гомеотичними білками та оцінив роль комбінаторної регуляції генів за допомогою декількох TF у визначенні специфічних для домену закономірностей експресії генів. Використовуючи ці мережеві підходи, ми виявили нові потенційні гени-кандидати, які відповідають за визначення різних морфологій та розмірів різних типів квіткових органів. Подальші дослідження потребуватимуть систематичного експериментального вивчення функцій конкретних регуляторних взаємодій, наприклад Використовуючи сайт-спрямований мутагенез цис-регуляторних областей та TFBS.

методи

Рослинні матеріали

PAP1: AP1-GR ap1 мулові рослини вирощували в ростовій камері в умовах довгих днів (16 годин світла, 8 годин темряви) з інтенсивністю світла 120 мкмоль/м 2/с, при цьому температура змінювалась від 22 ° C протягом вдень до 20 ° C вночі. Суцвіття збирали з рослин шламу pAP1: AP1-GR ap1 після вкручування (приблизно 2 см заввишки) та через 2, 4 та 8 днів після першої обробки дексаметазоном (щоденна обробка 2 мкМ дексаметазону, 0,01% (об./Об.) Етанолу та 0,01% Silwet L-77) для аналізу mRNA-seq та miRNA-seq.

Аналіз даних RNA-seq та ChIP-seq

Детальна методологія аналізу RNA-seq та ChIP-seq наведена в додаткових примітках 1 та 2.

Аналіз експресії мікроРНК та інших генів

Метод RT-qPCR-стовбурової петлі, описаний у Chen 76, був використаний для вимірювання експресії міРНК з невеликими змінами. Детальніше, загальну РНК екстрагували Trizol (Thermo Fisher Scientific, США), а РНК елюювали водою, обробленою DEPC, плюс 1 мкл інгібітора РНКази (Епіцентр, США). Для транскрипції штам-штам використовували триста нанограмів обробленої ДНКазою РНК у поєднанні з праймером стовбурової петлі (100 мкм), 10 мМ dNTP та водою без РНКази/ДНКази в кінцевому обсязі 13,5 мкл. Реакційну суміш нагрівали до 65 ° С протягом 5 хвилин, а потім охолоджували на льоду протягом 1 хвилини. Для проведення зворотної транскрипції використовували фермент Super Script III (Thermo Fisher Scientific, США). Для виявлення експресії гена мРНК загальну РНК екстрагували за допомогою набору GenUP-Plant RNA Kit (Biozyme, США) та проводили синтез кДНК з використанням зворотної транскриптази M-MuLV (NEB, США). Кількісну ПЛР проводили за допомогою SsoAdvanced® Universal SYBR® Green Supermix (Biorad, США), використовуючи систему виявлення ПЛР у реальному часі CFX96 Touch®. Послідовності праймерів, використані в цьому документі, можна знайти в додаткових даних 8.

Аналіз подвійної люциферази

Мережевий аналіз

Для оцінки стійкості мереж, що містять miRNA, ми проаналізували та порівняли мережеву структуру двох видів мереж: «метамережі», що складається як з регулювання, спрямованого TF, так і опосередкованого miRNA, та мережі без регулювання miRNA. В принципі, більш надійна мережа демонструє вищу ступінь допуску до видалення вузлів. Ми використовували функцію swan_combinatory у пакеті NetSwan у R, щоб обчислити опір мереж, що виникає внаслідок видалення вузла, використовуючи каскадний сценарій для видалення вузлів у порядку зменшення їх міжміжності. Було нанесено графік втрати зв’язку разом із часткою видалених вузлів (рис. 3б).

Далі ми систематично досліджували збагачення мотивів у метамережі. Ми зосередились на аналізі авторегуляції (1-вузол), циклу зворотного зв'язку (2-вузол) та 3-вузлових мотивів, які мають особливі біологічні наслідки 51. Мотиви мережі з 1 та 2 вузлами шукали за власним кодом, тоді як збагачення мотивів із 3 вузлами виконувалося за допомогою алгоритму FANMOD 54. Значимість мотивів визначали шляхом порівняння кількості спостережуваних мотивів з кількістю знайдених у 1000 випадково перемішаних мережах, як це було реалізовано у FANMOD. Щоб визначити, чи можливі фізичні взаємодії двох цілей на SIM-картці, дані з взаємодії білок - білок (PPI) були отримані з посилання. 79. Для кожного головного регулятора розраховували відсоток його цільових показників з потенційними ІЦВ у пов’язаних мотивах SIM. В якості контролю було відібрано таку ж кількість генів, як досліджуваний головний регулятор, із усього списку цільових генів для всіх 15 основних регуляторів, і аналогічне значення відсотків було розраховано, як вище. В результаті було отримано два набори процентних значень (n = 15) та порівняно з t-тестом Стьюдента (рис. 3f).

Визначення домен-специфічних генів

Дані про транслатоми AP1-, AP3- та AG-домену (за допомогою TRAP-seq) на стадіях 4 (S4) та 6 (S6) були отримані з посилання. 62. Специфічні для домену експресовані гени визначали за допомогою ANOVA з доменним ефектом P-значення 2 серед трьох доменів у S4 або S6. Загалом на цьому етапі було ідентифіковано 6072 гени, 2311 (38,1%) з яких були зв’язані більш ніж одним з 11 вибраних TF (включаючи AG, AP1, AP2, AP3, BLR, PI, SEP3, LFY, JAG, ETT, і RGA) і використовується для подальшого аналізу. Ген був визначений як AP1-специфічний (sepal), якщо він був сильно вираженим (більш ніж двократна зміна) в домені AP1, але не в AP3 або AG доменах. Подібне правило застосовується до AG-специфічних (карпельних) або AP3-специфічних генів. AP1/AP3-загальні (пелюсткові) гени визначали, якщо вони демонстрували високу експресію як в AP1, так і в AP3 доменах, але не в AG домені. Подібним чином були визначені гени, спільні для AP3/AG (тичинки). В результаті ми виявили 1013 специфічних для органів генів, і 678 з них були зв’язані більш ніж одним із 11 TF.

Моделювання внеску в зв'язування TF та експресії генів

Ми прийняли модель, засновану на регресії, для зв’язку динаміки експресії генів (678 специфічних для органів генів, як описано вище) та зв’язування TF (11 флористичних регуляторів), як описано в попередніх дослідженнях. Зокрема, ми пов’язали кратну зміну (FC) експресії генів між двома органами з лінійною комбінацією інтенсивності зв’язування 11 окремих TF та підготували логарифмічну модель:

$$ \ log _2Y_i = \ mathop \ limit_ ^ \ beta _jx_ + \ varepsilon _i, $$

де Y i - середнє значення FC гена i у S4 та S6 між двома органами, що порівнюються. TF-зв'язуючий бал x ij для TF j у гені i визначали нормалізованим піковим балом. Дані зв’язування TF були нормалізовані та середньоцентровані до моделювання. Регресію Лассо проводили за допомогою пакета glmnet в R для обчислення прямого внеску (тобто параметра β) кожного TF у зміну виразу. Оптимальна модель була обрана за допомогою п'яти повторень десятикратного перехресної перевірки з використанням пакету caret у R. Вищезазначений аналіз проводився за допомогою програми Shiny HTPmod 80 .

Статистичний аналіз та візуалізація даних

Якщо не вказано, усі статистичні аналізи та візуалізація даних виконувались у R. t-SNE (t-розподілене стохастичне вбудовування сусідів), аналіз проводився бібліотекою Rtsne, а вихідні дані візуалізували за допомогою нашого онлайн-інструменту HTPmod 80 (//www.epiplant .hu-berlin.de/shiny/app/HTPmod /). Ділянки вуликів були сформовані за допомогою бібліотеки HiveR. Візуалізація мережі здійснювалась за допомогою бібліотеки igraph.

Наявність коду

Конвеєр аналізу даних ChIP-seq адаптований з //github.com/PlantENCODE/plantGRNs. Усі інші спеціальні комп’ютерні коди можна отримати у відповідних авторів за обґрунтованим запитом.

Наявність даних

Усі дані, що підтверджують результати цього дослідження, доступні у статті або у файлах додаткової інформації. Дані mRNA-seq та miRNA-seq були депоновані в омнібусі NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) під номерами приєднання GSE110539.

Дякую

Ми хотіли б подякувати Йоганні Мюшнер за допомогу з RNA-seq та Лей Ван з Хуачжунського сільськогосподарського університету за допомогу в експериментах з геном-репортером люциферази. Ми хотіли б подякувати Центру інформаційних технологій та управління медіа (ZIM) при Потсдамському університеті за надання високопродуктивних обчислювальних ресурсів. KK хоче подякувати Фонду Олександра-фон-Гумбольдта та Федеральному міністерству освіти та досліджень за підтримку.