жирової

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Експресія IEX-1 збільшується в білій жировій тканині після годування HFD
  • Дефіцит IEX-1 робить мишей стійкими до ожиріння, спричиненого HFD
  • Дефіцит IEX-1 покращує метаболізм глюкози
  • Дефіцит IEX-1 інгібує HFD-індуковане запалення жиру та печінки
  • Відсутність IEX-1 збільшує витрати енергії через посилений термогенез
  • Дефіцит IEX-1 запобігає зміні фенотипу макрофагів у жировій тканині, спричинену HFD
  • обговорення
  • методи
  • Тварини та догляд за тваринами
  • Вимірювання цільної крові та плазми
  • Тести на толерантність до глюкози та інсуліну
  • гістологія
  • імуногістохімія
  • імуноблотинг
  • Виділення SVF та імунофенотипування
  • Вилучення РНК та кількісний аналіз ПЛР у реальному часі
  • Витрати енергії на цілі тварини та виробництво тепла
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Коментарі

предметів

реферат

Ожиріння є однією з найнебезпечніших проблем охорони здоров'я в наш час через його високу поширеність (59 мільйонів американців) та його асоціацію з різними хронічними захворюваннями, такими як діабет 2 типу, атеросклероз, гіпертонія, безалкогольна жирова печінка, імунно-опосередковані розлади та деяких видів раку.1. Це пов’язано з хронічним низьким рівнем активного запалення у важливих метаболічних тканинах, включаючи жирову тканину та печінку. Хронічне запалення змінює метаболізм глюкози та ліпідів і призводить до надмірного накопичення енергії та резистентності до інсуліну 2, 3, 4, 5, 6. Недавні дослідження дали суттєві докази того, що вроджена імунна відповідь та подальше запалення виникають набагато раніше, ніж початок ожиріння, і критично сприяють його патогенезу 2, 4, 5, 6. Зокрема, NF-κB, центральний медіатор запалення, відіграє важливу роль у запаленні, спричиненому дієтою. Блокада NF-κB та його наступних медіаторів захищає мишей не тільки від інсулінорезистентності, індукованої резистентністю до інсуліну, але й від ожиріння 5, 7, 8, що свідчить про фундаментальний зв’язок між запаленням та витратами енергії. Незважаючи на вагомі докази участі запалення в метаболічному дисбалансі, первинні медіатори, що порушують енергетичний баланс при великому споживанні жиру, не є повністю визначеними.

результат

Експресія IEX-1 збільшується в білій жировій тканині після годування HFD

Дефіцит IEX-1 покращує метаболізм глюкози

Відсутність IEX-1 збільшує витрати енергії через посилений термогенез

обговорення

Ожиріння - це хронічний розлад, який виникає через дисбаланс енергетичного обміну 2, 3, 5, 6, 8. Первинні фізіологічні регулятори витрат енергії, особливо при високому споживанні калорій, не до кінця зрозумілі. Тут ми представляємо раніше невідому роль IEX-1 в енергетичному обміні. Нульова мутація IEX-1 захищає мишей від розвитку ожиріння, спричиненого HFD, та резистентності до інсуліну. Миші IEX-1 -/- демонстрували збільшені витрати енергії через посилений термогенез. Спеціальні дослідження тканин показують, що дефіцит IEX-1 збільшує експресію термогенних генів і спричинює побуріння eWAT та scWAT, що узгоджується із спостереженням підвищеної експресії IEX-1 виключно в цих тканинах при харчуванні HFD. Це пояснює підвищений термогенез та витрати енергії у мишей KO, що забезпечує механічний огляд худого фенотипу цих мишей. Дослідження визначає IEX-1 як важливий модулятор енергетичного обміну під час високого споживання калорій і пропонує нову ціль для лікування ожиріння та інших метаболічних розладів.

Як недолік IEX-1 підтримує жирові ААМ, ще слід з'ясувати. IEX-1 сильно експресується в макрофагах 11, 12, 14. Він відіграє вирішальну роль у регуляції апоптозу в імунних клітинах і контролює їх неоднорідність 9, 12, 16, 33, 34, 35, 36. Наприклад, ми раніше повідомляли, що IEX-1 взаємно регулює виживання Т-клітин та апоптоз залежно від підмножини 16, 36. Дефіцит IEX-1 збільшує апоптоз Th1, одночасно сприяючи виживанню клітин Th17, що призводить до посиленої реакції IL-17 на мишачих моделях коліту та артриту. Можливо, індукована HFD активність IEX-1 у макрофагах переважно збільшує виживання підмножини CAM, але не AAM у жировому жирі завдяки його передбачуваній антиапоптотичній дії. Отже, дефіцит IEX-1 запобігає індукованому HFD збільшенню популяції CAM. Тим не менше, наші дані свідчать про те, що IEX-1 необхідний для індукованого HFD перемикача у фенотипі ATM, регулюючи тим самим AAM.

Жирові макрофаги відіграють вирішальну роль у асоційованому із ожирінням запаленні, перемикаючи їх фенотип із протизапального стану (ААМ) на прозапальний стан (САМ) у ожирілих жирах 7, 18, 37, 38. Дефіцит IEX-1 інгібував перехід таких ATM, і, отже, AAM були переважними ATM у WAT мишей IEX-1 -/- навіть після 20 тижнів HFD, забезпечуючи механізм, за допомогою якого дефіцит IEX-1 інгібував індуковане HFD запалення. Імовірно, збільшення популяції AAM та ослаблене запалення у мишей IEX-1 -/-, можливо, сприяло покращенню чутливості до інсуліну, що спостерігається у цих мишей 32, 39. IEX-1 може представляти нового посередника запалення, пов’язаного з ожирінням, ймовірно завдяки своїй ролі в регуляції фенотипу банкоматів. Таким чином, ми пропонуємо, щоб IEX-1 здійснював подвійну дію при ожирінні через банкомати; (i) він сприяє індукованому САМ запаленню і (ii) інгібує біогенез бежевого жиру.

На закінчення, у цьому дослідженні було визначено раніше недооцінену роль IEX-1 у регулюванні енергетики. Дефіцит IEX-1 спричинив побуріння та активізував термогенні гени у ВАТ, сприяючи альтернативній активації жирових макрофагів під час годування HFD. Отже, миші IEX-1 -/- були захищені від HFD-індукованого збільшення ваги завдяки посиленому термогенезу та збільшенню витрат енергії. Альтернативна активація макрофагів також послаблює запалення, спричинене ВЧР, та покращує резистентність до інсуліну. Чи залишається підтримка ААМ основним механізмом, за допомогою якого дефіцит IEX-1 стримує розвиток ожиріння, однак залишається визначити.

методи

Тварини та догляд за тваринами

Всі дослідження на мишах проводились відповідно до Керівництва NIH з догляду та використання лабораторних тварин. Усі дослідження були розглянуті та схвалені Підкомітетом з досліджень догляду за тваринами MGH. Мишей IEX-1 -/- генерували в нашій лабораторії, як описано раніше 17. У цьому дослідженні використовували самців мишей на тлі 129Sv/C57BL/6. Мишей IEX-1 -/- та їх односеменних підводних тварин, що харчуються дієтою з високим вмістом жиру (45% калорій з жиру; D12451 Research Diets Inc) або звичайним чау (13,2% калорій з жиру), починаючи з 8-тижневого віку протягом 20 тижнів. Тварин поселяли у специфічному приміщенні, що не містить патогенів, з 12-годинним світловим/12-годинним темним циклом у тваринницьких установах MGH та отримували їжу та воду за необхідністю. Записи ректальної температури визначали за допомогою прецизійного термометра FHC (FHC Bowdoin ME) близько полудня. Вагу тіла контролювали кожні 2 тижні протягом усього дослідження.

Вимірювання цільної крові та плазми

Цілу кров збирали в гепаринізовані пробірки, а плазму відокремлювали центрифугуванням. Концентрації інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою набору інсуліну ELISA (Crystal Chem Inc, Downers Grove IL). Глюкозу в крові вимірювали за допомогою глюкометра One Touch Ultra Accuchek. Загальний холестерин, тригліцериди та NEFA у плазмі крові вимірювали за допомогою колориметричного аналізу (Wako, Cambridge MA). TNF-α та IL-10 у плазмі крові вимірювали за допомогою наборів ELISA (eBioscience).

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Для IGTT мишам вводили внутрішньочеревно 1,5 мг глюкози/г маси тіла через 12 годин голодування 5. Глюкозу в крові вимірювали за базальну, 15, 30, 45, 60 та 120 хв від хвоста крові за допомогою глюкометра. Щодо ІТТ, мишам вводили внутрішньочеревно ін’єкцію 0,75 одиниці людського інсуліну (Novolin, Novo Nordisk) на кг маси тіла після 3 годин голодування 5. Концентрацію глюкози в крові визначали, як описано вище.

гістологія

Після розтину зразки фіксували зануренням у 10% забуференний формалін на 48–72 години, зневоднювали, очищали і потім вносили у парафін. Серійні зрізи (товщиною 5 мкм) отримували і депарафінізували, регідратували, а потім фарбували гематоксиліном та еозином. Потім зображення розрізів сканували за допомогою NanoZoomer та аналізували за допомогою програмного забезпечення для перегляду NDP (Hamamatsu, Bridgewater, NJ). Середню площу адипоцитів у 100 випадково відсортованих адипоцитів на зразок зрізів eWAT визначали за допомогою програмного забезпечення для перегляду NDP.

імуногістохімія

Зрізи тканин, закріплені у формаліні парафіну, депарафінізували та регідратували перед викриттям антигену кип’ятінням у 10 мМ цитрату натрію та проникненням 0,1% TBS-Тритоном протягом 15 хв. Ендогенну пероксидазну активність гасили інкубацією з 3% перекисом водню протягом 15 хвилин. Зрізи блокували в нормальній козячій сироватці та інкубували з первинним кролячим анти-IEX-1 (ab65152 Abcam, Cambridge MA) або анти-UCP1 (ab10983 Abcam) антитілом протягом ночі при 4 o C. Зрізи потім фарбували біотинільованим вторинним антирабітовим антитілом протягом 1 годину при кімнатній температурі та колір візуалізували за допомогою 3,3'-діамінобензидину (DAB), використовуючи комплект Vecta-stain ABC (Vector Laboratories). Зрізи для виявлення UCP1 фарбували полімерним АП проти кролячих вторинних антитіл протягом 30 хв при кімнатній температурі (Biocare Medical, Brookline MA), а колір візуалізували додаванням швидкого червоного хромогену (Biocare Medical). Перед зневодненням зрізи були забарвлені гематоксиліном та розміщення покривного скляного шару за допомогою монтажних середовищ. Слайди сканували за допомогою NanoZoomer та аналізували за допомогою програмного забезпечення для перегляду NDP (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).

імуноблотинг

Тканини збирали у фосфатному буфері RIPA, доповненому інгібіторами протеази та фосфатази (Sigma-Aldrich). Екстракти фракціонували за допомогою 4–20% гелю Miniprotein TGX (BioRad, Waltham MA), переносили в нітроцелюлозні мембрани та інкубували з первинними антитілами проти мишачого IEX-1 (1: 200; sc33171 Santa Cruz Biotech, Dallas TX), UCP1 (1: 5000 eWAT та scWAT та 1:20 000 для BAT, ab10983 Abcam) або α-тубуліну (abcam) протягом ночі при 4 o C. Після промивання мембрани інкубували з HRP-зв’язаним анти-кролячим IgG (технологія клітинної сигналізації) . Мембрани інкубували з ECLPlus (GE Healthcare, Вілмінгтон, Массачусетс), а хеміфлуоресценцію виявляли за допомогою візуатора Versadoc 4000MP. Захоплені зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH).

Виділення SVF та імунофенотипування

4-5 мишей-самців на генотип евтаназували під глибокою анестезією сумішшю кетаміну (120 мг/кг) + ксилазину (12 мг/кг), що вводили внутрішньочеревно. Епідидимальні ВАТ збирали та подрібнювали ножицями та розщеплювали 1 мг/мл колагенази II у PBS, що містить CaCl 2 (1,4 мМ) та BSA (0,5%), протягом 30 хвилин при 37 ° С у шейкері. Травлення зупиняли додаванням рівної кількості DMEM, що містить 10% FBS. Суспензію клітин фільтрували через фільтр 100 мкм, а потім обертали при 300 g протягом 5 хвилин для відокремлення плаваючих адипоцитів від гранул стромальної судинної фракції (SVF). Гранулу SVF ресуспендували в 0,5 мл буфера для лізису еритроцитів протягом 5 хв на льоду, центрифугували протягом 5 хв при 300 г і ресуспендували в буфері FACS (PBS з 2% BSA) при концентрації 6 × 10 6 клітин/мл. Клітини інкубували в темряві на льоду протягом 20 хвилин у блоці Fc (BD Pharmingen, Сан-Хосе, Каліфорнія). Без промивання клітини інкубували з флуоресцентно міченими антитілами: F4/80-фікоеритрин, CD11c-фікоеритрин-Cy7 та CD206-Alexaflour 647 протягом додаткових 30 хвилин за вказівкою виробника (BD Bioscience). Клітини аналізували за допомогою сортувальника клітин Fria Aria (BD Biosciences). Непофарбовані та поодинокі плями використовувались для встановлення компенсацій та воріт.

Вилучення РНК та кількісний аналіз ПЛР у реальному часі

Тканини або адипоцити та фракції SVF eWAT отримували від мишей під глибокою анестезією, як описано вище, і зберігали при -80 o C до екстракції. Загальну РНК екстрагували за допомогою Trizol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія). кДНК синтезували за допомогою набору синтезу першої ланцюга Superscript III (Invitrogen). Рівні експресії мРНК вимірювали кількісним ПЛР-аналізом у реальному часі (qRT-PCR) у Mastercycler realplex 2 (Eppendorf), використовуючи швидку суміш Kapa sybr або зондову швидку qPCR (Kapa Biosystems), використовуючи звичайний Sybr або taqman (для IEX-1) ґрунтовки. Зміни у відносній експресії генів нормалізувались до рівнів 18S мРНК і визначали за допомогою відносного методу Ct.

Витрати енергії на цілі тварини та виробництво тепла

Мишей IEX-1 -/- та WT (n = 4–5 на генотип), яких годували HFD або ND протягом 7–8 тижнів, поміщали у стандартні метаболічні клітини. Споживання кисню (VO 2), вироблення вуглекислого газу (VCO 2), вироблення тепла, спонтанну рухову активність та споживання їжі вимірювали за допомогою Комплексної системи лабораторного моніторингу (TSE system Inc), інтегрованого калориметра з відкритим контуром, оснащеного оптичним променем система моніторингу діяльності. Ці параметри контролювали протягом 3 днів поспіль (3 темних циклу та 3 світлих циклу), а середні значення за 3 дні використовували в аналізах. Коефіцієнт дихального обміну (RER) розраховували як відношення VCO 2 до VO 2. Склад тіла вимірювали за допомогою МРТ-аналізатора Echo (Medical Device Company, Х'юстон, Техас).

Статистичний аналіз

Усі дані виражаються як середнє значення ± стандартні помилки середнього значення (SEM). Різниці між двома групами або двома методами лікування, включаючи рівні мРНК IEX-1 та білка у ND та HFD, що годували мишей WT, та експресію мРНК цитокінів у ATM порівнювали з двостороннім t-тестом Стьюдента. Двосторонні повторні вимірювання ANOVA використовували для порівняння маси тіла, показників крові, рівня глюкози в крові під час IGTT та ITT, рівні експресії мРНК у eWAT, scWAT, BAT та печінці, VO 2 та виробництві тепла, а також відсотки CAM та AAM у SVF серед різні групи. Значення Р