Затвердження: 11 жовтня 2017 р
Ключові слова: Шлунок, гастроскопія, дихальний тест, виразка.
Анотація: Синдром виразкового шлунку коней (EGUS) - це багатофакторна сутність, яка виробляє ураження слизової шлунка. EGUS був пов'язаний з такими факторами ризику, як стабільність виробництва, постачання зерна, гіпергастрінемія через фізичні навантаження, стрес, нестероїдні протизапальні препарати (НПЗЗ) та дисбіоз (Helicobacter spp.). Метою цього дослідження було виявлення Helicobacter spp. на слизовій оболонці шлунка коней і визначити її зв'язок з EGUS. Було оцінено двадцять коней різних порід, обох статей, стайні. Проведено стравохід-гастродуоденоскопію та біопсію слизової залози. Зразки були подані на швидкий тест на уреазу (URT), а в досліджуваній популяції - тест на дихання сечовини (UBT). Були розроблені описова статистика та тест на чутливість/специфічність. Тести на виробництво уреази були менш чутливими щодо тесту «золотого стандарту» (агару сечовини); Не вдалося визначити відповідність між тестами на уреазу та наявністю Helicobacter spp, або EGUS. Не було встановлено відповідність між тестами та EGUS або Helicobacter spp., Це вимагає молекулярної діагностики.
Ключові слова: Шлунок, гастроскопія, дихальний тест на сечовину, виразка.
Хелікобактер є грамнегативною, мікроаерофільною, спіралеподібною, джгутикової бактерією, спочатку класифікованою до роду Campylobacter, але перекласифікованою в 1989 р. [14], завдяки детальному вивченню мікроорганізму, виявленого в пілоричному антрумі людини із захворюваннями шлунка, з тих пір Helicobacter pylori. Хоча її найвідомішою формою є спіраль, вона є плеоморфною. Сферичні форми (коккоїди) з’являються в умовах дефіциту поживних речовин, впливу антибіотиків або тривалого часу інкубації. Передбачається, що ці форми повертаються до бацилярного вигляду відповідно до особливих умов навколишнього середовища, повертаючи свою інфекційну здатність [1, 14].
Найвідоміший біохімічний профіль серед роду Helicobacter - це H. pylori, найбільш помітною ферментативною активністю якого є здатність гідролізувати сечовину, а також лужною фосфатазою, оксидазою та каталазою. Хоча активність уреази вважається відносно поширеною серед видів хелікобактерів, деякі з цих бактерій, що знаходяться в слизовій оболонці шлунка тварин, відрізняються за своєю ферментативною активністю та впливом на тканини.
Деякі мікроорганізми, знайдені у слизовій оболонці шлунку коней (Equus ferus caballus), як здорові, так і виразкові, були пов’язані з родом Helicobacter [3, 7, 8, 16], серед них H. equorum [12]; Однак участь Helicobacter у патогенезі виразкового синдрому коней (EGG) ще не встановлена, хоча існує припущення, що його присутність у слизовій оболонці шлунка коней є потенційним фактором ризику для даного синдрому. З цієї причини дане дослідження мало на меті виявити бактерії за допомогою тестів активності уреази, на додаток до встановлення зв'язку між СУГЕ та його присутністю.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Тип навчання та етичні аспекти
Дескриптивне, перспективне, поперечне перерізи було проведено за допомогою зручності вибірки. Дослідження було схвалено Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Антіокійського університету протоколом 3082013.
Стравохід - гастро - дуоденоскопія
Гастродуоденоскопію проводили після голодування протягом дванадцяти та чотирьох годин (год) для твердої та рідкої їжі відповідно. Проводили седацію 10% ксилазину (Anased®, Lloyd Laboratories, Айова, США) (0,5 мг/кг/в/в). Згодом ендоскопію виконували за допомогою системи відеоендоскопів (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, USA). Макроскопічні висновки класифікували за шкалою класифікації ступеня ураження шлунка, запропонованою MacAllister et al. [одинадцять].
Під час екскурсії ендоскопом закапували воду для поліпшення візуалізації слизової шлунка. Після проведення гастроскопічної оцінки та класифікації уражень із поверхні шлунка, слизової оболонки залози (очного дна) та пілоричної антруми було взято три біопсії шляхом введення гнучких транс-ендоскопічних щипців (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, США) для проведення швидких тестів на уреазу (PRU).
Швидкий тест на уреазу (PRU)
Для проведення PRU був підготовлений модифікований бульйон сечовини [13], що складається з 500 мл дистильованої води; 100% сечовина (Merck, Дарнштадт, Німеччина) 10г; фенол червоний 0,005г; Соляна кислота 97% 0,2 мл; отриманий рН становив 7, виміряний через смужку індикатора рН. Бульйон розподіляли аликвотами в обсягах 0,5 мл і депонували у криофауми по 2 мл, кожна взята біопсія повністю занурювалась у бульйон та маркувалась. Зразки у відварі інкубували при кімнатній температурі протягом 12 год для подальшого зчитування.
Реакція уреази базувалася на наявності середовища, багатого сечовиною, яке також містило показник рН (феноловий червоний). Коли джерело ферменту уреази було занурене (в даному випадку мікроорганізми з уреазною активністю), воно відповідало за гідроліз сечовини, що знаходиться в середовищі; вивільнення амонію та вуглекислого газу в результаті реакції подщелачило середовище і спричинило зміну кольору від жовтого (негативного) до інтенсивного червоного кольору фуксії, що свідчить про позитивну реакцію на активність уреази (ФІГ. 1).
Двадцять зразків слизової залози відібрано у двох примірниках для піддавання відвару сечовини та агару сечовини ("золотий тест"), що використовуються у лабораторії ветеринарної мікробіології факультету аграрних наук Університету Антіокія, щоб підтвердити результат між ними ЗМІ. Сечовинний агар складався з базового гелю (Urea agar Base Christensen® Merck Millipore, MA, США) 3,6 г, солі сечовини (Carlo Erba Reagents SAS, Chaussée du Vexin, FR) 7,5 г та 5 крапель 97% соляної кислоти . Для підтвердження ефективності відвару використовували посівний матеріал мікроорганізму з позитивною уреазною активністю (Proteus spp.).
Тест на дихання (Тест на дихання сечовиною - UBT)
У кожного коня було зроблено базальний вдих, вводячи в ніздрю скляну трубку (флакон Exetainer® для тестування дихання 13С, Labco Limited, Великобританія), тоді як контралатеральну одночасно закупорювали, коли у коня закінчився, трубку негайно закривали. Згодом кожній особі давали 50 мг сечовини C 13 (партія U23001), розведену в 5 мл води, і наносили безпосередньо на слизову шлунка через робочий канал зонда ендоскопа. Потім, через 10 хвилин після подачі реагенту, повторний вдих (видих) брали в іншу скляну пляшку. Кожну пробірку зчитували на мас-спектрометрі із співвідношенням ізотопів (автоматичний аналізатор дихання CO2 ABCA2, Sercon® limited, Великобританія). Результат, який засвідчив співвідношення газів більше 2Δ (дельта), вважався позитивним. Очікувана хімічна реакція представлена у такому рівнянні: 13 CO (NH2) + H2O → 2 NH 3 + 13 CO2
Статистичний аналіз (чутливість та специфічність діагностичних тестів)
Щоб визначити здатність діагностичних тестів виявляти справжні позитивні реакції уреази, було проведено порівняння кривих ROC (робоча характеристична крива приймача) між PRU, UBT та агаром сечовини («золотий тест»). Цей аналіз був проведений за допомогою програмного забезпечення EPIDAT® V 3.1.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
Не було виявлено значної відстані між стандартною лінією (діагональ) та оціненими кривими PRU та UBT (рис. 2), що вказувало на те, що результати відносяться до випадковості, а не до відповідності золотому тесту (тест Чи 2 = 0,1728; Значення Р = 0,6777). Аналіз кривої ROC показав, що ні PRU, ні UBT не є чутливими до виявлення активності уреази (ТАБЛИЦЯ I) порівняно з тестом на золото.
SE = стандартна помилка; ДІ = довірчий інтервал; PRU = швидкий тест на уреазу; UBT = Тест на дихання сечовиною
(ТАБЛИЦЯ II) детально показує результати кожного з проведених випробувань, відповідно до коня. Слід зазначити, що були обрані фрагменти слизової залози, оскільки вона вважається тією частиною, де інфікується Helicobacter spp. Не вдалося встановити взаємозв'язок між тестами PRU та UBT, а також між кожним із них та реакцією уреази на сечовинний агар.
PRU = швидкий тест на уреазу; UBT: Тест на дихання сечовиною; М. Залозиста = слизова залоза.
Коли оцінювали здатність PRU або UBT прогнозувати виразку шлунка, було очевидно, що ні за яких обставин частота позитивів не схилялася до тих осіб, які мали виразку (будь-якого ступеня).
PRU проводили не у всіх регіонах шлунка у всіх тварин, його розглядали переважно для тих, у яких виявлено ураження шлунка ступеня ≥2 (тяжкість). Як показано на фіг. 2 та ТАБЛИЦЯ I, тести на виявлення активності виявились не дуже чутливими щодо обраного тесту на золото (сечовинний агар). Деякі «слабко-позитивні» результати в PRU були також слабко-позитивними для UBT, це пояснюється гелікобактеріозом, оскільки H. pylori, утворюючи важке ураження, має тенденцію до зниження активності уреази; Така поведінка тесту UBT засвідчена у людей, які, хоча вони позитивні та мають клінічну картину, сумісну з гелікобактеріозом, сумнівно позитивні до UBT.
Можливо, тести на виявлення активності уреази працюють краще при поверхневих ураженнях, оскільки на цьому рівні дисбіоз коменсальних мікроорганізмів не відбувся, навпаки, при серйозних травмах субстрат для мікроорганізмів зникає, і вони остаточно зменшуються або гинуть. Повідомляється, що тимчасова інсуфляція шлунку під час ендоскопії перешкоджає UBT, оскільки штучна оксигенація впливає на активність уреази, крім того, погане голодування викликає перешкоди між залишками їжі та активністю уреази [5].
З іншого боку, відомо, що існують інші мікроорганізми, які продукують уреазу в шлунку коней, такі як Proteus miribialis, Pseudomona aureginosa [2], Klebsiella spp. та Yersinia spp. [7], що може заплутати результати тестів на активність уреази і, отже, зробити їх невпевненими у визначенні Helicobacter spp. [7]. Lactobacillus salivarius та Sarcina ventriculi виявлені як у здоровій слизовій оболонці шлунка коней, так і у виразкових ураженнях; крім того, при виразковому ураженні були виявлені Enterococcus faecium та Escherichia fergusonii поверхневий та інтраепітеліальний відповідно [10]. З іншого боку, H. equorum, який був спеціально виділений від коней, як здорових, так і хворих, не має уреазної активності [9], що свідчить про те, що деякі з цих мікроорганізмів можуть брати участь у патофізіології СУГЕ і не бути виявлені за допомогою тести на активність уреази.
Ще однією проблемою тестів на уреазу є можлива кислотність шлунка, присутня у пацієнтів із СУГЕ, це пояснюється кривою шлункового рівня рН/уреази активності Helicobacter; пік активності уреази настає при рН шлунка 7,5, не виявляється активності нижче рН 4,5, а при рН 4 інактивація є незворотною [9], що означає, що у тих осіб, де той самий рН шлунка передбачався або менше 4 тест може бути хибно негативним щодо Helicobacter spp. У випадку цього дослідження рН не вимірювали в різних частинах шлунка, тому цю інформацію не можна підтвердити. Ідеально перевірити рН шлунка та пов’язати його із появою виразок у різних відділах шлунка, на додаток до відповідності його активності уреази [4].
Крім того, виявлено, що деякі епігенетичні фактори (нікель як апофермент) та генетичні фактори, такі як здатність мРНК достатньо перекладати порядки генів, що регулюють вироблення уреази, впливають на чутливість тестів виявлення уреази. Внутрішньобактеріальна активність уреази Helicobacter регулюється щонайменше трьома способами: по-перше, швидкою реакцією через активацію UreI; по-друге, повільніша реакція, заснована на підвищеній активації ферменту, і по-третє, хронічна відповідь РНК-месенджера, що стимулює синтез нової уреази; Всі ці фактори говорять про те, що уреаза-позитивні мікроорганізми, такі як Helicobacter spp., Можуть існувати, включаючи участь у SUGE, але їх неможливо легко виявити за допомогою тестів на виявлення уреази.
Було б можливо розглянути можливість повторення тестів в однакових умовах для визначення їх мінливості та відтворюваності [15], або, наприклад, провести повторний аналіз. Варіабельність тесту також визначається стадією інфекції, яку переживає пацієнт [15], і рН зразка як такого, що може затримати реакцію фенолового червоного; таким чином, щоб під час розробки тестів можна було виявити деякі помилкові позитивні та помилкові негативні результати, а поєднання клінічних ознак та зібраних параклінічних доказів є найкращим методом діагностики гелікобактеріозу у коней. Крім того, молекулярна діагностика вважається ключовим інструментом при з'ясуванні наявності Helicobacter spp. у слизовій оболонці шлунка цих коней.
Труднощі з виділенням Helicobacter spp. Щоб підтвердити свою участь у SUGE, це робить дослідження похибкою типу II, тобто підтверджує, що мікроорганізм не пов'язаний з наявністю уражень шлунка, коли він насправді асоційований; Однак участь інших уреазно-позитивних мікроорганізмів може призвести до помилок I типу, що пов'язує позитивність із представленням СУЖЕ, коли його причинно-наслідковий зв'язок насправді не є певним. Однак кілька досліджень повідомляють про наявність мікроорганізмів, сумісних з видами хелікобактерів, як у цілісній, виразковій, так і у запаленій слизовій оболонці шлунка [8], що породило суперечки щодо їх участі у СУГЕ. Отже, продовжують вимагати молекулярних досліджень, щоб визначити його значимість при патології шлунка коней, як це очевидно у людей.
У цьому сенсі дослідження, проведене на тваринах із громадського постачання в Чилі, виявило 65% -ну позитивну реакцію уреази та спостереження за викривленими спіральними бактеріями типу Helicobacter у групі виразкових шлунків на очному дні та пілоричній антрумі [7], показавши більші реакції у очне дно, яке відрізняється від повідомленого для інших видів. На відміну від цього, це дослідження показало позитивну активність уреази при ураженнях, що перевищують або дорівнюють 2 ступеням, у 6% пілоричних антремурів та 0% у слизовій залози. Можливо, ця різниця була пов'язана з тим, що дискримінація порцій не враховувалась у роботі Cardona et al. [7]. Ці висновки спонукають до проведення більш конкретних досліджень для повної ідентифікації мікроорганізмів, що беруть участь у цих реакціях.
У цьому дослідженні не було встановлено відповідності між ураженнями шлунка та активністю уреази; Дуже важливо врахувати, що ці результати неоднозначні, оскільки використовувані тести (PRU та UBT) не дуже чутливі у порівнянні з агаром сечовини (золотий стандарт). Тому недоречно називати "швидкий тест на уреазу" як "діагностичний тест" на Helicobacter spp. Необхідно підтвердити весь його біохімічний та молекулярний профіль для його правильної ідентифікації, а також для визначення оптимального часу між забором зразка та введенням у відвар сечовини. Крім того, бракує досліджень щодо визначення кращих ділянок для росту спіральних бактерій на шлунковій поверхні коня для його ізоляції, згідно з висновками, знайденими та повідомленими іншими авторами.
Тести на виявлення активності уреази для діагностики Helicobacter spp. у коней вони неоднозначні і легко втручаються в такі умови, як погане голодування та наявність коменсальних мікроорганізмів з подібними біохімічними профілями, їх не слід використовувати для діагностики гелікобактеріозу, для цього доцільно проводити молекулярну діагностику. Також його не слід використовувати як метод прогнозування виразкових уражень на слизовій оболонці шлунка коней.
Ветеринарній лабораторії мікробіології Університету Антіокія, Комітету з розвитку досліджень (CODI) Університету Антіокія за фінансову підтримку, надану роботі, Стратегії сталого розвитку на 2013 - 2014 рр., А також COLCIENCIAS у програмі молодих дослідників 2015 року.
[1] БАЙОНА, М.; GUTIÉRREZ, A. Біофільм: механізм виживання Helicobacter pylori. Преподобний U.D.C.A Актуальний. & Divulg. Науковий. 16 (2): 335-342. 2013 рік.
[2] БЕЛЛІ, К.; ФЕРНАНДЕС, В.; SILVA, L. Позитивний тест на уреазу у дорослих коней з виразкою шлунку-Helicobacter spp. Архів. Інститут.Біолог. 70 (1): 17-20. 2003 рік.
[3] БЕЗДЕКОВА, Б .; FUTAS, J. Види хелікобактерів та виразка шлунка у коней: клінічне дослідження. Ветеринар. Med. 54 (12): 577–582. 2009 рік.
[4] КАМАЧО, П.Л.; ЕНДРЮС, Ф.М. Синдром виразки шлунка коней. У: Робінзон, Небраска; Sprayberry, KA. (Під ред.). Сучасна терапія Робінзона в медицині коней. 7-е видання Св. Лой: Elsevier. Pp 280-284. 2015 рік.
[5] КАМПУЗАНО, Г. Оптимізований дихальний тест на 13С-сечовину для діагностики інфекції H. pylori. World J. Gastroenterol. 13 (41): 5454-64. 2007 рік.
[6] CAMPUZANO, G. Неінвазивна діагностика хелікобактер пілорі: ¿серологія, 13-дихальний тест на С-сечовину або антигени хелікобактер пілорі в калі. Med. & Lab. 13 (5-6): 211–231. 2007а.
[7] КАРДОНА, Дж .; СТІНИ, Г.; ФЕРНАНДЕЗ, Х. Визначення Helicobacter spp., Виразка шлунка у коней. Преподобний МВЗ. Кордова. 14 (3): 1831-1839. 2009 рік.
[8] КОНТРЕРИ, М.; МОРАЛЕС, А.; ГАРЧА, М.; ДЕ ВЕРА, М.; БЕРМÚДЕЗ, В.; ГЕНЕ, П. Виявлення гелікобактер-подібної ДНК у слизовій оболонці шлунка чистокровних коней. Lett. Застосування: мікробіол. 45 (5): 553–7. 2007 рік.
[9] HEPBURN, R. Дослідження присутності хелікобактеру в шлунку коней шляхом тестування уреази та полімеразної ланцюгової реакції та подальше дослідження застосування тесту крові 13C-сечовини на коні. Лісбург: Політехнічний інститут Вірджинії та Державний університет. Дипломна робота. 63-71. 2004 рік.
[10] ВПЕРЕШЕНО, Л.; ДЖЕНСЕН, Т.; ОЛСЕН, С.; MØLBAK, L. Обстеження уражень шлунка коней на бактерії, включаючи Helicobacter spp. шляхом флуоресценції in situ гібридизації. BMC Microbiol. 19: 10-84. 2010 рік.
[11] МАКАЛІСТЕР, К.Г .; ЕНДРЮС, Ф.М .; ДЕЕГАН, Е .; СТОК, З.; ОЛОВСОН, С. Г. Система балів при виразці шлунка у коня. Рівне Ветеринар. J. 29 (6): 430-3.1997.
[12] МОЯЕРТ, Х.; ДЕКОСТЕР, А.; ВАНДАММЕ, П.; ДЕБРУЙН, Л.; МАСТ, Дж .; БАЕЛЕ, М.; КІЛЕН, Л.; ДЮКАТЕЛЬ, Р .; HAESEBROUCK, F. Helicobacter equorumsp. лист., уреазахисний вид хелікобактер, виділений із фекалій коня. Інтернат. J. Система. Еволут. Мікробіол. 57 (Пт 2): 213-8. 2007 рік.