пухирців

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • результат
  • Експрес-формула кілометрів один від одного під час органогенезу зебри
  • Порушення регуляції відстань один від одного порушує розвиток волосяних клітин та вушних фолікулів
  • Порушення регуляції відстані впливає на експресію генів, пов’язаних зі слухом, в ембріонах даніо
  • Виживання клітин волосся може бути пов'язане з функцією відстані придушення zBax2 та підтримка zMcl1b
  • обговорення
  • Матеріали і методи
  • Етичне твердження
  • Зміст та збір ембріонів
  • Синтез МО та мРНК з обмеженим відстань один від одного
  • мікроін’єкції
  • Спостереження за вушними пухирцями
  • В ти тут гібридизація на місці
  • Фарбування волоскових клітин для підрахунку та виявлення апоптозу/смерті
  • RT-PCR та qPCR
  • Статистичний аналіз
  • глосарій

предметів

  • апоптоз
  • Система слуху
  • Розвиток нервової системи
  • генетика

реферат

Головний

Втрата слуху завдає шкоди не тільки фізичному та психічному здоров’ю, але й збільшує соціальне та економічне навантаження. Пошкодження слуху можуть бути спричинені різними факторами, включаючи порушення волосяних клітин та структур внутрішнього вуха, але несправні молекулярні мішені залишаються невловимими. Таким чином, виявлення нових молекулярних механізмів, пов’язаних із процесами розвитку слухових органів, таких як первинна міграція нейромастіки, формування внутрішнього вуха, диференціація та підтримка клітин волосся, а також апоптоз клітин волосся сприятиме кращому розумінню втрати слуху. патології. Цей розвиток знань сприятиме розробці нових препаратів для профілактики ототоксичності та захисту слуху.

У цьому дослідженні ми вивчили функції миль даніо у розвитку та виживанні волоскових клітин та нейромаст, і повідомили про першу асоціацію віддаленої активності милі з розвитком нейромаст, клітин волосся та вушних пухирців, а також вираження слухові гени та сімейство генів bcl-2. Ми робимо висновок, що Mil може бути важливим регулятором формування та підтримки органів слуху у зебр. Наші висновки сприятимуть кращому розумінню процесів розвитку слуху та полегшать дослідження отопротекторних засобів.

результат

Схема вираження миль на відстані під час органогенезу зебри

Гібридизація in situ через вершину була використана для виявлення моделі просторово-часової експресії, віддаленої одна від одної під час ембріонального розвитку даніо. Вираз, віддалений від кілометрів, агрегувався переважно в енцефалічній області, особливо на межі середнього та заднього мозку та черевного заднього мозку; і слабка експресія також спостерігалася у сомітів, але не у нотохордів при 24 hpf (малюнки 1а, a та a). У фарингеальній фазі (48 к.с.) транскрипція фокусується на відстані миль від середнього мозку/заднього мозку, середнього мозку, черевного заднього мозку та дощок підлоги нервової трубки та судин. майбутні нейромасти на бічних лініях (малюнки 1b, b 'і b' '). Однак протягом періоду висиджування (72 к.с.) віддалених миль мРНК не виявляли в бічних лініях і в задній пластині підлоги, але все ще були сильно виражені на кордоні середнього мозку/заднього мозку, в стовбурі мозку і пластині підлоги (Рисунок 1c ). ). Ці результати дозволяють припустити, що модель вираження за милю корелює з розвитком нервової системи, включаючи мозок, центральну нервову трубку та нервову сенсорну систему у даніо.

Схема вираження на відстані миль під час органогенезу у зебри. Гібридизацію in situ проводили з антисенсорним зондом РНК за милі від ( a ), ( b ) a ( c ); Зонд чуттєвого чуття, віддалений від точки, використовувався як зонд негативного контролю ( d ). Вентральні зрізи відбирали з ембріонів для первинного зображення голови та штамів. Цілі тіла були показані при 1 dpf ( a ), 2 dpf ( b ) і 3 dpf ( c ); відповідні заголовки були показані в ( a ') a ( b ') та їх штами були показані в ( a '') a ( b ''). Чорні стрілки вказують на заплановані положення нейромаст на пост-латеральних лініях в ( b ''). Чорні напівкруглі дужки підписали середню/задню межу кордону в ( a ') a ( b '). На всіх малюнках голова ліворуч, хвіст праворуч; задня частина ніг вгору, нижня частина пластини. Шкала становить 310 мкм в ( a ) a ( b ), 330 мкм v ( c ), 380 мкм v ( d ), 160 мкм v ( a '), ( b '), 130 мкм v ( a ''), 180 мкм v ( b '')

Повнорозмірне зображення

Порушення регулювання відстані один від одного порушує розвиток волосяних клітин і вушних фолікулів

Дефекти розвитку отолітів та напівкруглих каналів, спричинені порушенням регуляції, віддаленими від кілометрів. Ембріонам вводили 40 мкМ MOmil або 40 нг/мкл mil-мРНК на одній-чотирьох стадіях клітин і спостерігали при 2 dpf ( a ) і 3 dpf ( b ). Порівняно з ембріонами WT, у морфантів з'явилися незвичайні форми морських свинок при 2 dff, такі як збільшені та неовальні вуха (чорні стрілки) та усадка мішків (помаранчеві стрілки) за допомогою ін'єкції MOmil (9/10). Хоча в контрольній групі misMO отоліти мають форму (12/13), подібну до форми WT (10/10). На ембріонах, оброблених ін'єкцією мРНК за милі, виявляється деформований, розділений або схожий на синцитій мішок (червоні стрілки) та менші шлуночки (чорна стрілка) шляхом ін'єкції мРНК за милі (11/12). Гістограма показує, що варіації розмірів отолітів, спричинені нокдауном генів або надмірною експресією генів, використовують кілометри площі отоліту, в яких як маркер використовували відношення мішечків до площі утрикулів. Композиції та SD отримують із зазначених вушних пухирців. ** Значення P

Експресія генів, пов’язана зі слухом, у личинок даніо зменшилася або збільшилася вниз. Транскрипція слухових асоційованих генів hmx2, fgf3, fgf8a, foxi1, otop1, pax2.1 та tmieb була досліджена методом RT-PCR у 48 ембріонів hpf та виявлена ​​залежною від концентрації у морфантів (і c ) і збільшилася в віддалених від міліметрів ембріонах, яким вводили мРНК ( e a f ). На верхніх панелях показані репрезентативні результати електрофорезу RT-PCR для MOmil ( a ) і мРНК, ін'єктовану мРНК ( e ) та відповідні гістограми сканування щільності триразових RT-PCR призводять до ( c a f) ). Контрольна група була змодельована за допомогою введеного misMO і показана в ( b ) a ( d ). * Р-значення

Апоптоз волоскових клітин був викликаний нокдауном. Личинок даніо при 6 dpf фарбували у змішаному розчині трьох барвників протягом 30 хвилин при 28 ° C, відповідно до інструкцій набору. a ) Зображення нейромачти ml1 у личинок, яким вводили MOmil при 40 або 500 мкМ та misMO 40 або 500 мкМ окремо, порівняно з WT ml1 нейромаст. b ) відповідна гістограма для малюнка 5а. ( c ) Зображення Neuromast O2 обробляються так само, як і neuromast ml1 MOmil та misMO, окремо. d ) відповідна гістограма для малюнка 5c. * Р-значення

Попередні дослідження показали, що Mil відповідає за контроль міграції та злиття серцевих клітин-попередників в області серця та подальшу диференціацію у функціональний орган при серцево-судинному розвитку. 5, 8, 24 У цьому дослідженні ми виявили, що функція Mil може частково брати участь у міграції та розвитку попередників волоскових клітин та пронейромастичних примоді у ALL та PLL (рис. 3). Функціональна узгодженість Майлза в різних органах свідчить про фундаментальну спільну роль Мілса в контролі міграції клітин-попередників та їх розташування в органогенезі даніо.

Це дослідження вперше дає докази того, що функція генів, розташованих на відстані кілометрів, бере участь у розвитку вушних пухирців та бічних волоскових клітинних ліній та нейромастів у даніо, і що зміна рівнів Mil може регулювати експресію гена zBax2 та Mcl1B сімейства bcl-2.,

Матеріали і методи

Етичне твердження

Це дослідження проводилось у суворій відповідності з рекомендаціями, викладеними в Положенні про лабораторне управління тваринами Міністерства науки і технологій Китаю. Протокол був схвалений Комітетом з етики експериментів на тваринах Інституту медичних біотехнологій Китайської академії медичних наук (IMBF20060302).

Зміст та збір ембріонів

Штам риби даніо (Danio rerio) WT Tuebingen спочатку був отриманий з Університету наук про життя Пекінського університету. Риб розміщували при 28,5 ± 1 ° C у 14/10 годинному циклі світло-темно. 27 ембріонів отримано природним спарюванням; Відповідні стадії синхронних ембріонів збирали та реєстрували за допомогою hpf та dpf 28. Ембріони фіксували 4% параформальдегідом у забуференному фосфатом фізіологічному розчині для гібридизації in situ або занурювали в реактив Trizol (Invitrogen) для виділення мРНК. Пігментацію в ембріонах понад 24 к.с. було попереджено інкубацією у фенілтіосечовині (PTU) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) перед фіксацією.

Синтез МО та мРНК з обмеженою відстанню один від одного

Антисмислові морфолінові олігонуклеотиди MOmil та misMO були розроблені та придбані у Genetools (Philomath, OR, USA; //www.gene-tools.com). MOmil використовували для гальмування трансляційних кілометрів шляхом прив'язки до місць ініціації за милі з послідовністю 5'-CCGCAAACAGACGGCAAGTAGTCAT-3 '. Контроль misMO 'був розроблений для негативного контролю впорскування, в якому було втрачено п'ять основ і підкреслено в послідовності 5'-CCCCAAACACACCGCAACTACTCAT-3'. Обидва МО повторно розчинили в 1,0 мкмоль/мл вихідного розчину в ddH 2 O.

Послідовність CDNA на кілометрі була клонована з ембріонів WT 24 hpf методом ланцюгової реакції зворотної транскриптази полімерази (RT-PCR) та праймерів, сконструйованих відповідно до послідовності пробігу даніо, про яку повідомляв GenBank (NM_001159970) та ідентифікованої секвенуванням (Sangon Biotech, Шанхай), Китай). Цю ДНК використовували як шаблон для синтезу мРНК із замкнутим циклом з використанням набору Ambion mMESSAGE mMACHINE T3 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США), і продукт перевіряли на якість та вихід за допомогою електрофорезу.

мікроін’єкції

Для фарбування клітин волосся 1 нл 20 мкМ MOmil або 20 нг/мкл мРНК із замкнутим циклом на одній-чотирьох стадіях клітин вводили окремо в ембріони WT; принаймні п'ять личинок при 6 дпф використовували для підрахунку волосяних клітин нейромаст o1, 02, ml1, ml2 та io4 та для підрахунку нейромаст на пост-латеральних лініях. Для спостереження за живими личинками у вухах і для підрахунку клітин волосся, ембріонам вводили на тій же стадії 1 нл 20 мкМ MOmil або 20 нг/мкл мРНК з рознесеною кришкою. Для фарбування клітин волосся методом апоптозу 1 нл MOmil при 40 мкМ та 500 мкМ та misMO при однакових концентраціях вводили в одноклітинні до чотириклітинних ембріонів; потім личинки збирали при 6 дпф. Для RT-PCR-аналізу генів, пов’язаних зі слухом, вводили 1 нл 10, 20 або 40 мкМ MOmil і 10, 20 або 40 нг/мкл герметично закритих мРНК. та сама ембріональна стадія. Ембріони інкубували та збирали при 48 к.с. Для qPCR-аналізу zBax2 та zMcl1b 1 нл 40 мкМ MOmil та 50 нг/мкл закритої мРНК окремо вводили в ту саму ембріональну фазу. Ембріони інкубували в тих же умовах, що і вище.

Спостереження за вушними пухирцями

Морфологію та структуру вушних пухирців у ембріонів Zebrafish, яким вводили мРНК, вводили в WT, MOmil та Mil при 48 і 72 к.с., спостерігали під диференціальним контрастним мікроскопом IX71 (Олімп, Токіо, Японія) та реєстрували за допомогою цифрової камери 500D ( Canon, Токіо, Японія). У кожній групі є більше 10 личинок для підрахунку отолітів та гістограма.

Гібридизація in situ in situ

Для синтезу зонда in vitro РНК послідовність генів, розташована на відстані один від одного (кілометри), була вставлена ​​в pBluescript KS (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США), який потім використовувався як шаблон для синтезу чуттєвого та антисмислового РНК-зонда за допомогою кілометрів набору для поділу РНК DIG (Roche Applied Sciences, Базель, Швейцарія). Щоб визначити закономірності експресії WT в милях один від одного, ембріони збирали при 24, 48 і 72 hpf. Ембріони, оброблені ін'єкціями MOmil або мРНК, а також контролі WT, збирали при 48 hpf. для придушення пігментації перед фіксацією у 4% параформальдегіді протягом ночі при 4 ° С. Ембріони обробляли ДНКазою перед гібридизацією для видалення псевдопозитивних втручань, викликаних геномною ДНК. Подальші кроки процедури гібридизації in-mount на місці виконували стандартний протокол. 29

Фарбування волоскових клітин для підрахунку та виявлення апоптозу/смерті

Для підрахунку клітин волосків личинок даніо при 6 dpf знеболювали в 0,016% трикаїну (Sigma-Aldrich) та інкубували у флуоресцентному барвнику YO-PRO-1 (Invitrogen) з кінцевою концентрацією 1 мкмоль/л для фарбування клітин волосся. ядра 30 з п’яти нейромаст, o1, ml1, ml2, o2 та io431, які були розташовані на поверхні вушної пухирця навколо. Потім личинки візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа з інверсною фазою IX51 (Olympus). У кожній групі є п’ять личинок для фарбування та підрахунку клітин волосся. Фотографії були зроблені за допомогою камери Canon 500D.

RT-PCR та qPCR

Стіл в натуральну величину

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз усіх даних (середнє значення ± SD) проводили з використанням односторонніх тестів ANOVA, а значення P 0,05 позначали як значущі. Дані зі стовпчиками в гістограмах представляють усереднені значення та SD, які отримані принаймні з трьох варіантів здійснення.