• Тут:
  • Почніть
  • Навчання без модуля
  • Досягнення в редагуванні геному за допомогою CRISPR Cas 9

Досягнення в редагуванні геному за допомогою CRISPR Cas 9

CRISPR: Кластеризовані регулярно рознесені короткі паліндромні повтори, згруповані та регулярно розташовані короткі паліндромні повтори

редагуванні

Застосування систем CRISPR-Cas розвивалося в останні роки з моменту виявлення його присутності в бактеріях. З тих пір його використання пропонується в різних галузях, таких як сільське господарство, вивчення генетично заснованих захворювань на клітинних та тваринних моделях, у виробництві ферментованих продуктів, стійкості до антибіотиків у бактеріях та як можлива генна терапія.

1987 рік: Йошізумі Ісіно виявляє існування паліндромних повторюваних послідовностей в ДНК кишкової палички.

1993 рік: Francisco J. M. Mojica, шляхом секвенування частини геному галофільних бактерій архей, що населяли солоні площі Санта-Пола, ідентифікує паліндромні послідовності 30 пар основ, відокремлених один від одного фрагментами 36 пар основ, так звані розпірки.

2000 рік: Група, очолювана Франциско Дж. М. Мойкою, виявила, шукаючи в базах даних, велику кількість цих повторюваних послідовностей у бактерій, архей та мітохондріях та запропонувала назву CRISPR, що означає "Кластеризовані та регулярно взаємопроміжні короткі паліндромні повтори".

2002 рік: Група голландських мікробіологів описує набір генів, що кодують нуклеази, пов'язані з послідовностями CRISPR (гени cas або CRISPR-асоційовані)

2005 рік: Встановлено, що деякі розпірки в системах CRISPR походять від джерел ДНК вірусів та плазмід. Дослідницька група Франсіско Дж. Мойки припускає, що пов'язані розпірки можуть бути частиною імунної системи бактерій.

2008 рік: Джон ван дер Уст показує, що у бактерії E-Scherichia coli розпірники, які походять від фага, транскрибуються в РНК, яка називається CRISPR РНК (crRNAs), яка зв'язується з ДНК вірусу і направляє білки Cas до цільової ДНК для проведення дволанцюгового різання.

2009 рік: Показано, що CRISPR-Cas9 створює цільові розриви дволанцюжкової ДНК у точних положеннях, а також підтверджується, що Cas9 є єдиним білком, необхідним для розщеплення в системі CRISPR-Cas9.

2011 рік: Еммануель Шарпентьє з Університету Уме виконує невелику послідовність РНК у Streptococcus pyogenes, яка містить систему CRISPR-Cas9, і виявляє, що крім рРНК існує друга РНК, яку він називає трансактивацією РНК CRISPR (tracrRNA). Це також показує, що tracrRNA працює разом з crRNA, щоб спрямовувати Cas9 до своїх цілей.

2012 рік: Вчені Еммануель Шарпентьє та Дженніфер Дудна з Каліфорнійського університету в Берклі демонструють, як використовувати CRISPR як програмований інструмент редагування, який може вирізати будь-яку нитку ДНК in vitro.

2013 рік: Дослідник Фен Чжан успішно адаптує систему CRISPR-Cas9 для редагування геному в еукаріотичних клітинах, для цього вони розробляють два різні ортологічні гени Cas9 і демонструють специфічне розщеплення геному в клітинах людини та миші.

Геном бактерій складається з двох ланцюгів кругової ДНК, ці нитки є комплементарними один одному. Коли ми читаємо геном, який складає приблизно 4 або 5 мільйонів літер, ми бачимо серію повторень, які повторюються кілька разів по всьому геному і які розташовані на відстані. Кожна з цих повторюваних одиниць називається CRISPR, це "Кластеризовані та регулярно проміжні короткі паліндромні повтори. Короткі сегменти спейсерної ДНК з ДНК вірусу бактеріофагів виявляються після кожного повторення. Дуже близько до цих повторів ви можете знайти гени cas, які кодують тип нуклеазних білків, які є виконавцями активності CRISPR.

Бактерії, як і люди, заражатимуться вірусами, які розпізнаватимуть бактерії за специфічними рецепторами на їх мембрані. Вірус буде впроваджувати свій генетичний матеріал всередину бактерій і використовуватиме власний механізм бактерій, щоб виробляти тисячі вірусних частинок, які порушують оболонку бактерій і потрапляють у навколишнє середовище для зараження інших. Бактерії, які пережили атаку вірусу, врятують фрагмент ДНК від вірусу і включать його як спейсер у свою систему CRISPR-Cas і збережуть покоління за поколінням. Ці спейсери будуть транскрибовані в РНК, яка називається "CRIPR РНК" (crRNAs), яка буде діяти як орієнтир для білка Cas і яка зв'язуватиметься з ДНК вірусу, що вторгається, у разі повторного зараження тим самим вірусом.

Коли той самий вірус знову заразить бактерію, кРРНК, відповідна спейсеру цього вірусу, приєднається до подвійного ланцюга ДНК вірусу шляхом комплементарності. Після того, як він приєднається до подвійного ланцюга ДНК за допомогою трансактиваційної РНК (tracrRNA), вони направлятимуть білок Cas 9, який є ендонуклеазою, що призведе до зрізу подвійної ланцюга ДНК вірусу, таким чином запобігаючи зараженню. Тому система CRISPR-Cas вважається набутою системою імунітету в різних організмах.

У 2012 році вчені Еммануель Шарпентьє та Дженніфер Дудна продемонстрували, як використовувати CRISPR як програмований інструмент редагування, який можна використовувати для вирізання будь-якого подвійного ланцюга ДНК in vitro. Таким чином, можна запрограмувати систему перейти до певного положення будь-якої ДНК і вирізати її, для цього вони використовують найпростішу систему CRISPR, яка базується на білку під назвою Cas 9. Вони продемонстрували, що це варто з інформацією Cas9 та направляючої РНК, яка має комплементарну послідовність фрагмента, який ви хочете вирізати, ви змішуєте це з фрагментом, в якому ви хочете зробити зріз, і білок Cas 9 піде туди, куди направляюча РНК направляє його, і скоротить у позиції, яку ви вказуєте.

Білок Cas 9 робить дволанцюжковий зріз, діє як молекулярні ножиці на ДНК. Система CRISPR має можливість націлювання на певну послідовність. Молекула РНК, що складається з 20 рибонуклеотидів (crRNA), поєднується з 20 нуклеотидами ланцюга ДНК та білком Cas9 - це рестрикційний фермент з високою специфічністю, який призведе до порізу в певному місці.

Коли відбувається подрізання подвійного ланцюга ДНК, фізична безперервність буде порушена, і інформація може бути втрачена в наступному раунді поділу в наступних клітинних циклах, тому клітина має два механізми відновлення ДНК.

Існує два механізми ремонту:

Об'єднання негомологічних кінців:

Цей зріз виявляється і починає випадково розкладатися і додавати нуклеотиди з ефектом блискавки. Можливо, початкова структура змінена, і нуклеотиди будуть вставлені або видалені, тому у нас буде так званий "Індель", і відбудеться порушення генів. Цей ген перестане працювати. Нам достатньо генерувати мутанта, який би вирізав певну ділянку ДНК. Це нас цікавить у тому випадку, якщо ми хочемо втратити функціональність гена.

Гомологічний прямий ремонт:

Якщо ми дамо системі послідовність, гомологічну областям, що прилягають до вирізу, і які містять нові послідовності, ці послідовності будуть інтегровані, оскільки комірка буде використовувати її як шаблон. Коли йому доведеться відремонтувати, він спробує дотримуватися цього шаблону та вводити послідовності, яких раніше не було, або може бути включена мутація, або мутація може бути видалена і правильна послідовність відновлена. CRIPSR лише розрізає ДНК, але запускає процес відновлення.

Ці дві форми відновлення дозволяють вивчити функціональність гена, вивчити генетично засноване захворювання, яке має мутацію, інсерцію або заміну.

Редагування геному

Необхідні елементи

Спочатку ми маємо цільову послідовність дволанцюжкової ДНК, яку ми хочемо вирізати. У нас буде провідна РНК, яка утворена РНК, яка зв'язується з цільовою послідовністю, і трансактиваційна РНК, яка вказує на білок Cas 9, де він повинен бути розташований для виконання розрізу. І нарешті, білок Cas 9, який є ендонуклеазою, що виконує скорочення-

Для полегшення редагування геному була розроблена керівна РНК (гРНК), яка являла собою химерну РНК, що містить усі основні компоненти crRNA і tracrRNA. Було розроблено кілька варіантів CRISPR/Cas9, які розпізнають 20 або 24 nt послідовності, які відповідають сконструйованим послідовностям гРНК та 2-4 nt послідовностям PAM на цільових сайтах. Отже, CRISPR/Cas9 теоретично може націлювати певну послідовність ДНК із 22–29 нт, що є унікальним для більшості геномів. Однак нещодавні дослідження показали, що CRISPR/Cas9 мав високу толерантність до невідповідності пар базових між гРНК та її комплементарною послідовністю цілі.

Різні функції системи CRISPR

Програми CRISPR-Cas9

Виробництво ферментованих продуктів для запобігання забрудненню бактеріальних культур вірусами.

Набір бактерій можна проводити відповідно до розпірок, які вони містять.

Стійкість до антибіотиків

Вибірковий антимікробний дизайн.

Створюйте клітинні або тваринні моделі генетично заснованих захворювань

Виконайте епігенетичні модифікації

Культури, стійкі до екстремальних умов

Повільне дозрівання плодів

Худоба з більшою м’язовою масою

Безпечні органи тварин для трансплантації людини

Вилікувати/запобігти захворюванням. Віруси: ВІЛ, герпес, гепатит В, мононуклеоз. інфекційний.

Стійкі до малярії комарі

Соматична генна терапія

Процедури CAR-T.

Обмеження CRISPR:

Поза ціллю: Порізи можуть відбуватися в послідовностях, відмінних від цільової мети.

Імуногенність: Системи CRISPR-Cas походять від бактерій і можуть викликати імунну відповідь, якщо ми зазнали попереднього зараження цим мікроорганізмом. Приклад: Streptococcus Pyogenes.

Виживання генетично змінених клітин.

Ми не можемо контролювати ефективність в гомологічному ремонті (HDR).

Ефективність, специфічність тканин та ефективність передачі.

Мозаїцизми: Зміни можуть відбутися не у всіх клітинках.