транспортуються

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • ACS Faa1 та Faa4 беруть участь у поглинанні LCB
  • Зниження поглинання LCB в клітини faa1 Δ faa4 Δ не спричинений збільшенням виходу ЛКБ або зміною складу ліпідів
  • Імпорт LCFA та LCB є конкурентоспроможним
  • Поглинання LCFA та LCB відрізняються за своїми енергетичними потребами
  • ACSL ссавців беруть участь у поглинанні LCB
  • Обговорення
  • Методи
  • Дріжджові штами та середовища
  • Культура клітин
  • Плазміди
  • Аналіз поглинання ліпідів
  • Аналіз вивільнення DHS
  • [3 H] Аналіз маркування DHS
  • Імуноблот
  • В пробірці Аналіз АСУ
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

Резюме

Вступ

Клітини поглинають різноманітні позаклітинні речовини через плазматичну мембрану і використовують їх як джерела енергії або попередників біомолекул. Оскільки гідрофобний бар’єр, утворений ліпідними бішарами, не дозволяє транспортувати гідрофільні матеріали, клітини повинні імпортувати їх через певні транспортери. Однак ще не зроблено висновку про те, чи потрапляють гідрофобні матеріали, такі як жирні кислоти (ФК), до клітин у фізіологічних умовах шляхом пасивної дифузії або транспортерів.

До цього часу транспортна діяльність FA членів сім'ї ACS не була експериментально перевірена з використанням очищених білків через технічні труднощі, властиві таким аналізам in vitro, що призвело до суперечок щодо того, чи функціонує ACS лише при активації. транспорт 5, 8. У першому випадку ACS може спричинити очевидне збільшення поглинання LCFA, захоплюючи LCFA як ацил-CoA, щоб вони не дифундували у позаклітинні простори або зменшуючи внутрішньоклітинну концентрацію LCFA. В останньому випадку транспорт і активація LCFA ACS будуть пов'язані, процес називається векторним ацилюванням.

Сфінголіпіди є одним з основних ліпідних компонентів еукаріотичних мембран і мають широкий спектр фізіологічних функцій, включаючи адгезію клітин, формування бар'єру проникності шкіри, підтримку мієліну, імунітету, сперматогенезу та метаболізму глюкози 9, 10, 11, 12, 13, 14 15. Керамід, гідрофобний кістяк сфінголіпідів, складається з ФА та довголанцюгової основи (ЛХБ). Найбільш поширеним LCB у ссавців є сфінгозин (SPH), який містить транс подвійний зв’язок між положеннями C4 і C5 (рис. 1а). SPH і насичений дигідросфінгозин LCB (DHS) існують всюди серед тканин ссавців. Дріжджі не мають SPH, але містять DHS і фітосфінгозин (PHS), які мають гідроксильну групу в положенні С4 16 (рис. 1а). У ссавців PHS існує у певних тканинах, таких як шкіра, тонка кишка та нирки 9 .

Повнорозмірне зображення

Не всі ліпіди можна транспортувати до клітин: скоріше, лише деякі класи ліпідів, включаючи LCFA, LCB та моноацилгліцерини, можуть робити це ефективно. Ефективність поглинання інших класів ліпідів, таких як складні сфінголіпіди, кераміди, S1P, триацилгліцерин та гліцерофосфоліпіди, є низькою. Хоча природні кераміди та гліцерофосфоліпіди з LCFA майже не ввозяться в клітини, як вони є, укорочення фрагменту FA дозволяє їм (тобто штучним коротколанцюговим керамідам та гліцерофосфоліпідам) потрапляти. Крім того, ефективність транспортування насичених LCFA, таких як пальмітинова кислота та стеаринова кислота, висока, а насичених VLCFA, таких як арахідова кислота та бегенова кислота, низька. Отже, ми можемо зробити висновок, що ліпіди, які можуть ефективно проникати в клітини, мають спільну структуру: довголанцюговий гідрофобний кістяк і невелику групу полярних голів.

Ми припускаємо, що структурним фактором, що обмежує транспорт деяких ліпідів до клітин, є субстратна специфічність одного або декількох поширених транспортерів. Тому ми дослідили участь ACS у поглинанні LCB з використанням генетично відстежуваних дріжджів. Ми виявили, що поглинання LCB значно зменшилось у мутанта подвійної делеції ACS (faa1Δfaa4Δ). Крім того, транспорт LCFA та LCB був взаємно конкурентоспроможним. Ці результати свідчать про те, що Faa1 і Faa4 виступають як транспортери як LCFA, так і LCB. Труднощі у відмежуванні транспорту LCFA від метаболічної активності (додавання CoA) створили давню дискусію про роль ACS у поглинанні LCFA, як описано вище. Однак ця суперечка не стосується LCB: вони не мають карбоксильної групи, акцептора CoA, тому стадія активації, що каталізується ACS, не може мати місце в LCB. Наші результати чітко розмежовують діяльність транспорту та ACS для LCB і вказують на те, що ACS виконує транспортну функцію. Крім того, ми виявили, що члени сімейства ACSL, гомологи ссавців ACS Faa1 та Faa4, беруть участь у транспорті LCB у ссавців.

Результати

ACS Faa1 та Faa4 беруть участь у поглинанні LCB

Спочатку ми дослідили часовий хід поглинання [3 H] DHS і порівняли його з часом поглинання [3 H] пальмітинової кислоти. Імпорт DHS був швидким і почав стабілізуватися приблизно через 5 хвилин (рис. 1b). Транспорт пальмітинової кислоти був повільнішим, ніж DHS, і лінійно збільшувався до 30 хвилин (рис. 1в). З огляду на ці результати, ми встановлюємо 5 хвилин і 30 хвилин як відповідні інкубаційні періоди для аналізів поглинання [3 H] DHS та [3 H] пальмітинової кислоти в наступних аналізах. Потім ми досліджували швидкість поглинання [3 H] DHS при різних концентраціях. Швидкість його поглинання зросла майже лінійно до 40 мкМ (рис. 1г).

25% з клітин дикого типу, кількість, яка добре корелювала з кількістю, отриманою в результаті аналізу поглинання ліпідів (рис. 1д). Таким чином, транспорт DHS був зменшений у клітинах faa1Δfaa4Δ, і перевірено корисність аналізу поглинання ліпідів.

Потім ми вивчили участь Faa1 і Faa4 у транспортуванні двох інших LCB, PHS та SPH, до клітин. DHS і PHS - це природні LCB у дріжджах. З іншого боку, SPH, який є основною LCB у ссавців, у дріжджах не існує, але його можна імпортувати та метаболізувати, якщо його додати екзогенно 26, 28, 29. Ми виявили, що не тільки поглинання DHS, але також SPH та PHS зменшувались у клітинах faa1Δfaa4Δ (рис. 1g). Ці результати вказують на те, що Faa1 та Faa4 беруть участь у поглинанні всіх типів досліджуваних LCB.

Якщо Faa1 і Faa4 функціонують у поглинанні LCB як ліпідні переносники, вони повинні бути локалізовані в плазматичній мембрані. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми дослідили місце розташування Faa1 та Faa4, хромосомно злитого з GFP, шляхом мікроскопічного спостереження. Ми виявили, що Faa1-GFP знаходиться головним чином у плазматичній мембрані (рис. 1h). Faa4-GFP також був локалізований у плазматичній мембрані, але лише частково; більша частина була розташована у внутрішніх органелах. Часткова локалізація Faa4 у плазматичній мембрані відповідає слабкій транспортній активності Faa4 (рис. 1д).

Зниження поглинання LCB у клітинах faa1Δfaa4Δ не викликане збільшенням виходу LCB або зміною складу ліпідів

Теоретично, можливо, очевидне зменшення поглинання LCB у клітинах faa1Δfaa4Δ було спричинене посиленим потоком. Тому, щоб виключити цю можливість, ми провели аналіз вивільнення LCB, використовуючи [3 H] DHS. Після завантаження клітин [3 H] DHS протягом 1 години вимірювали кількість [3 H] DHS, що виділяється протягом наступних 10 хвилин. Клітини дикого типу вивільняли 13% попередньо завантаженого DHS (рис. 2а). Кількість вивільненого DHS було трохи вищим у клітинах faa1Δfaa4Δ (15% попередньо завантаженого DHS [3 H]). Однак це незначне збільшення не може пояснити значного зменшення поглинання DHS, яке спостерігається у клітинах faa1Δfaa4Δ (рис. 1д). Швидше за все, різниця в кількості DHS, що виділяється між клітинами дикого типу та faa1Δfaa4Δ, могла бути спричинена різницею в їх діяльності щодо імпорту, оскільки частка звільненого DHS знову потрапила в клітини протягом інкубаційного періоду.

Імпорт LCFA та LCB є конкурентоспроможним

Наші висновки вказують на те, що Faa1 і Faa4 беруть участь як у поглинанні LCFA, так і в LCB. В умовах конкуренції субстратів два (або більше) субстрати одного ферменту конкурують між собою і метаболізуються з різною швидкістю, залежно від концентрації та спорідненості ферменту. Якщо Faa1 і Faa4 виступають транспортерами як LCFA, так і LCB, LCB повинна конкурентно перешкоджати транспортуванню LCFA і навпаки. Коли аналіз поглинання [3 H] DHS проводили у присутності пальмітинової кислоти, імпортований DHS зменшували залежно від дози пальмітинової кислоти (рис. 3а). Додавання пальмітинової кислоти у концентраціях, що дорівнюють та в 4 рази перевищують концентрації DHS, спричинило відповідне зменшення імпортного [3 H] DHS на 85% та 92% (порівняно з імпортованими рівнями за відсутності пальмітинової кислоти).

Потім ми вивчили конкурентне пригнічення поглинання DHS іншими ФА. Пальмітинова кислота та арахідонова кислота (C20: 4) пригнічують поглинання DHS (рис. 3в). Арахідова кислота (C20: 0) також обмежувала всмоктування, хоча і слабо. З іншого боку, лауринова кислота (C12: 0), пальмітолеїнова кислота (C16: 1) та 2-гідроксипальмітинова кислота не мали ефекту. Тому кількість видів FA, які конкурентно перешкоджали транспортуванню DHS, була обмежена.

Поглинання LCFA та LCB відрізняються за своїми енергетичними потребами

Щоб отримати інформацію про енергетичні потреби для поглинання LCB, ми провели аналіз поглинання LCB у присутності азиду натрію та 2-дезокси-D-глюкози, які руйнують клітинний АТФ. Лікування азидом натрію/2-дезокси-D-глюкози пригнічує поглинання пальмітинової кислоти до 44% рівнів, що спостерігаються в необроблених клітинах (рис. 4а). З іншого боку, те саме лікування не впливало на транспорт DHS до клітин (рис. 4b). Ці результати вказують на те, що ATP необхідний для транспортування LCFA, але не для імпорту DHS. Тому, хоча LCFA та DHS, здається, транспортуються до клітин за допомогою одних і тих же транспортерів, їх енергетичні потреби різні.

Потім ми вивчаємо вплив цих мутацій на поглинання DHS. Кількість DHS, що транспортується в клітинах, що експресують Faa1 D538A, була майже ідентичною кількості клітин, що містять вектор (рис. 4g), що вказує на те, що Faa1 D538A майже не мав транспортної активності DHS. Отже, активність ACS Faa1 D538A добре корелювала як з його пальмітиновою кислотою, так і з транспортною діяльністю DHS. З іншого боку, транспортна активність DHS Faa1 S271A не корелювала з його активністю ACS. Хоча Faa1 S271A мав лише залишкову активність ACS (рис. 4e), його транспортна активність DHS була еквівалентна активності білка Faa1 дикого типу (рис. 4g). Оскільки Ser271 є добре збереженим залишком у мотиві АТФ-АМФ, він, ймовірно, має важливе значення для використання АТФ. Разом з результатом, отриманим при обробці азидом натрію/2-дезокси-D-глюкози (рис. 4а, б), ці результати вказують на те, що транспорт DHS і пальмітинової кислоти різняться з точки зору їх використання АТФ (або відсутність їх).

ACSL ссавців беруть участь у поглинанні LCB

Тепер ми поширюємо наше обговорення поглинання LCB від дріжджів на ссавців. Спочатку ми вивчили часовий хід абсорбції [3 H] DHS та [3 H] пальмітинової кислоти за допомогою клітин епітелію тонкої кишки IEC-6. І імпорт [3 H] DHS, і [3 H] пальмітинової кислоти поступово почав стабілізуватися приблизно через 10 хвилин (рис. 5a, b). Потім ми досліджували конкурентне поглинання пальмітинової кислоти порівняно з DHS. Імпорт [3 H] пальмітинової кислоти гальмував DHS, і навпаки (рис. 5c, d), вказуючи на існування загальних транспортерів LCFA та LCB у ссавців, таких як дріжджі.

Потім ми дослідили участь ACSL у поглинанні DHS, використовуючи клітини IEC-6 та інгібітор ACSL триаксин C. Лікування тріацином C спричиняло зменшення транспорту як [3 H] пальмітинової кислоти, так і [3 H] DHS (рис. 5g, h). Ці результати вказують на те, що ACS ссавців ACSL і ACSVL4 також беруть участь у поглинанні LCB, подібно до їх дріжджових аналогів.

Обговорення

Підсумовуючи, тут ми виявили, що ACS (Faa1 та Faa4 у дріжджах та ACSL1, ACSL4, ACSL5, ACSL6 та ACSVL4 у ссавців) беруть участь у поглинанні LCB. Крім того, ми надали важливу інформацію про молекулярний механізм транспорту LCFA. Наші висновки сильно підтверджують гіпотезу про те, що АКС мають транспортну активність, хоча це необхідно додатково перевірити за допомогою аналізів in vitro з використанням очищених білків. LCB представляють великі перспективи як корисні інструменти для аналізу функцій транспортування ACS.

Методи

Дріжджові штами та середовища

Культура клітин

Епітеліальні клітини тонкої кишки щурів (клітинна лінія IEC-6 47) були забезпечені RIKEN BRC і вирощені в модифікованому середовищем Eagle Dulbecco (DMEM; Sigma, Сент-Луїс, США), що містить 10% FCS і доповнений 100 U/мл пеніциліну 100 мкг/мл стрептоміцину (Sigma) та 4 мкг/мл інсуліну (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія). Triacsin C був придбаний у лабораторії Alomone (Єрусалим, Ізраїль).

Плазміди

Аналіз поглинання ліпідів

Аналіз поглинання ліпідів із використанням клітин IEC-6, вирощених на 12-лункових посудинах, проводили, як описано нижче. Поживне середовище було замінено на 0,5 мл DMEM без FCS, але містить 4 мкг/мл інсуліну. Після однієї години інкубації при 37 ° С клітини обробляли 6 мкл розчину ліпідів (0,1 мкКі та кінцева концентрація 5 мкМ) при 37 ° С протягом відповідних періодів часу. Клітини охолоджували на льоду, а середовище видаляли. Клітини промивали 0,5 мл холодного PBS, що містить 1 мг/мл BSA, не містить FA, суспендували в 0,5 мл цього ж розчину, виймали з посуду за допомогою скребків, переносили в пластикові пробірки і осаджували центрифугуванням (750 г, 4 ° С, 3 хв). Ліпіди екстрагували суспендуванням клітин у 120 мкл хлороформу/метанолу (2: 1, об./Об.). Радіоактивність, пов’язану із середньою та клітинною фракціями, вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника LSC-3600. Транспортну активність розраховували як радіоактивність у фракції клітин на загальну радіоактивність і виражали у відсотках.

Аналіз вивільнення DHS

Дріжджові клітини мітили [3 H] DHS (0,1 мкКі, 3,3 нМ) при 30 ° C протягом 5 хв. Потім клітини охолоджували на льоду, промивали холодною середовищем YPD, що містить 1 мг/мл BSA, двічі і суспендували в холодній середовищі YPD, що містить 1 мг/мл BSA. Клітини з рівною кількістю радіоактивності інкубували при 30 ° С протягом 10 хв. Потім клітини (фракція А) охолоджували на льоду і відокремлювали від середовища (фракція В) центрифугуванням. Радіоактивність у фракціях А і В вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника LSC-3600. Відсоток вивільненого DHS для кожного зразка розраховували як (радіоактивність у фракції B)/[загальна радіоактивність (радіоактивність у фракціях A + B)] × 100.

[3 H] Аналіз маркування DHS

[3 H] Аналіз маркування DHS проводили, як описано раніше 26, 49 .

Імуноблот

Імуноблотинг проводили, як описано раніше 50, використовуючи анти-DYKDDDDK (FLAG) (0,5 мкг/мл; Wako Pure Chemical Industries), анти-FLAG M2 (1 мкг/мл; Agilent Technologies), анти-СНІД (розведення 1: 1000; BioROIS, Токіо, Японія), або антитіло проти Pgk1 (1 мкг/мл; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) як первинні антитіла та фрагмент IgG F (ab ') 2, кон'югований HRP, проти миші або проти кролика ( кожне розведення 1: 7500; GE Healthcare Life Sciences, Бакінгемшир, Великобританія) як вторинні антитіла. Виявлення проводили з використанням підкладки для промокання Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific) або Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer Life Sciences, Уолтем, США).

Аналіз ACS in vitro

Загальні фракції мембран готували, як описано раніше 40. Загальні фракції мембран (0,2 мкг) інкубували з 10 мкМ [3 H] пальмітинової кислоти при 37 ° C протягом 2 хв у 100 мкл буфера ACS [200 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 мМ АТФ, 8 мМ MgCl 2, 2 мМ EDTA, 20 мМ NaF, 0,1% Тритон X-100 і 0,5 мМ CoA]. Реакцію припиняли додаванням 500 мкл ізопропанолу/н-гептану/1 MH 2 SO 4 (40: 10: 1, об/об). Для видалення непрореагованої [3 H] пальмітинової кислоти екстракцію н-гептаном проводили тричі. На кожній стадії до зразків додавали 500 мкл н-гептану, потім органічну фазу (що містить [3 H] пальмітинову кислоту) відокремлювали від водної фази (що містить продукт реакції [3 H] пальмітоїл-КоА) центрифугуванням (17000 г, 4 ° C, 5 хв). Нарешті, радіоактивність, пов'язану з отриманою водною фазою, вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника LSC-3600.

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Наріта, Т. та ін. Довголанцюгові основи сфінголіпідів транспортуються в клітини через ацил-КоА-синтетази. Науковий співробітник. 6, 25469; doi: 10.1038/srep25469 (2016).

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов та правил спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.