20 червня 2012 р., Автор статті: Лазарова Катаріна, Ліки
Том 5, номер 6 Додати допис

схильності

Ми вважаємо остеопороз різнофакторним захворюванням, яке призводить до зниження якості життя, оскільки зменшення міцності кісток веде до зменшення міцності кісток. В даний час наукове співтовариство приділяє пильну увагу аналізу генів-кандидатів, які можуть корелювати з розвитком остеопоротичної хвороби. Це дослідження фокусується на аналізі гена OPG.

1. Вступ

Остеопороз - одне з найпоширеніших захворювань серед населення. В основному це стосується людей похилого віку, обох статей та всіх етнічних груп. Остеопороз характеризується зменшенням кісткової маси та порушенням мікроархітектури. Ці фактори призводять до збільшення частоти переломів. Ризики остеопорозу можна змінювати залежно від способу життя та фіксованих ризиків, які є спадковими. [1]


Фіг. 1 Порівняння кісткової маси здорової кістки та кістки, ураженої остеопорозом [2]

2. Генетичні схильності до остеопорозу

Як уже зазначалося, остеопороз - це багатофакторна хвороба, яка впливає на взаємодію між впливами навколишнього середовища та генами, а також між самими генами. У багатьох випадках підтверджено зв'язок між поліморфізмами генів, що беруть участь у метаболізмі кісток, та розвитком остеопоротичної хвороби. Поліморфізми багатьох генів корелюють із початком цього патологічного стану. На це вказують також результати аналізів досліджень близнюків та сімей, які свідчать про те, що спадковість МЩКТ коливається від 25% до 85%. Вплив спадковості, безсумнівно, відіграє вирішальну роль у регуляції кісткової маси, і, за винятком рідкісних випадків, успадкування МЩКТ є полігенним. [1]

У межах генетичних схильностей, які можуть призвести до цього патологічного стану, ми виділяємо багато генів. Однією з причин можуть бути поліморфізми в гені OPG (ген, що кодує остеопротегерин), VDR (ген, що кодує рецептор вітаміну D), LRP 5 (білок рецептора ліпопротеїну 5), поліморфізм гена COLIA (ген колагену), TGF-β1 ген (ген, що кодує трансформуючий фактор росту), IGF-1 (ген, що кодує фактор росту інсуліну), і ген IL6 (ген інтерлейкіну 6). [3]

OPG

OPG був ідентифікований під час проекту кДНК щурів. Ця група дослідників мала справу з рецептором TNF. OPG відіграє важливу роль в остеобластогенезі. Його біологічний ефект полягає у пригніченні активності та диференціації остеокластів. Важкий остеопороз спостерігався у мишей з цілеспрямованою делецією гена OPG. Значно нижчий дистальний радіаційний показник МЩКТ спостерігається у осіб, гомозиготних за рецесивним алелем (GG), порівняно з гетерозиготами та гомозиготами для домінантного алелю при SNP 245T/G та 163A/G. OPG та RANKL пов’язані з виникненням переломів кісток та МЩКТ у хребті та попереку. [4]

Поліморфізм A163G

Поліморфізм A163G ідентифікується в області промотору OPG. Частота поліморфізму A163G суттєво переважала у пацієнтів з переломами хребців. У дослідженні жінок кавказького посту в менопаузі фахівці виявили зв'язок між поліморфізмом A163G та частотою переломів попереку та зап'ястя [5].


Рис.2 Поліморфізми в проксимальній області OPG [4]

3. Матеріал і методологія роботи

Виділення ДНК з крові

У цій роботі ми використовували щічні мазки та зразки периферичної крові, отримані від пацієнтів з діагнозом остеопороз, які були надані Osteocentrum Prešov. ЕДТА використовували як антикоагулянт у зразках крові. Ми проаналізували 110 зразків, дотримуючись усіх етичних та правових стандартів, необхідних для ходу дослідження.

Матеріал та хімікати для ізоляції:

Для виділення ДНК із зразків периферичної крові ми використовували комплект для ізоляції ДНК крові UltraClean® (Non-Spin), який призначений для виділення високомолекулярної геномної ДНК. Індивідуальні хімічні речовини: буфер G1, G2, РНКаза A, G3, 100% ізопропанол, 70% етанол, буфер G4. Матеріал та пристосування: епендорфи, піпетки, наконечники піпеток, вихор, центрифуга Hettich Mikro 200R, термостат CH-100.

Процедура введення реакції ПЛР у реальному часі:

  1. Хімічні речовини та матеріали ПЛР у режимі реального часу:
    • Хімікати:
      • TaqMan® Genotyping Master Mix, Applied Biosystems від Life Technologies, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США,
      • TaqMan rs3102735; C___1971046_10, Applied Biosystems від Life Technologies, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США
      • H2O від Міліпора
    • Матеріал:
      • MicroAmpTM Fast Optical 48-лункова реакційна пластина (0,1 мл), Applied Biosystems від Life Technologies, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США
      • Оптична клейка плівка MicroAmp® з 48 лунками, прикладні біосистеми компанії Life Technologies, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США
      • піпетки різного обсягу, наконечники піпеток
  2. Пристрої:
    • Багатофункціональна центрифуга JOUAN B4i, кабінет біологічної безпеки класу Esco (BSC)
    • Система ПЛР у режимі реального часу StepOne із застосованими біосистемами комп’ютерного управління фірмою Life Technologies, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США

ПЛР у режимі реального часу StepOne надає можливість аналізу даних з різних точок зору за допомогою багатокомпонентного дисплея. Перевага цього пристрою полягає в тому, що він здатний ідентифікувати зразок, відповідно. отвір у пластині, який може негативно вплинути на весь аналіз. Він здатний виявляти барвники FAM, VIC, SYBR Green, ROX. StepOne визначає положення та інтенсивність сигналів флуоресценції, барвників, пов’язаних з кожною флуоресценцією, та значимість кожного сигналу.

  • Дизайн зонда та грунтовки:
    Ми використовували зонд для ампліфікації бажаного ділянки гена OPG: TaqMan rs3102735; C___1971046_10
    Розташування: хромосома 8
    Організм: Homo sapiens
    Родовід: Еукаріота; Метазої; Хордати; Краніата; Хребетні; Евтелеостомія; Ссавці; Евтерія; Euarchontoglires; Примати; Гаплорріні; Катарріні; Hominidae; Гомо
    контекст послідовності (VIC/FAM):
    CTCTAGGGTTCGCTGTCTCCCCCAT [C/T] AATTCCCTGGTCTAGAAGTTAGACT
    поліморфізм: передача C/T
    генний символ: TNFRSF11B OPG; TR1; OCIF (www.bioinfo.appliedbiosystems.com)
  • Параметри окремих циклів:

    • до циклів температури ПЛР після ПЛР етап утримання фази утримання фази 50 циклів утримання фази денатурація температури час збір даних
    60 ° C 95 ° С 92 ° С 60 ° C 60 ° C
    00:30 10:00 0:15 1:30 1:30
    Так ні ні Так Так

    4. Результати та обговорення

    До аналізованої групи входило 110 осіб з діагнозом остеопороз. Ми проаналізували зразки методом ПЛР у реальному часі. У цьому дослідженні ми вивчали поліморфізм гена OPG A163G, який найчастіше описується у зв'язку з остеопорозом.

    Вкладка. 1 Середній віковий склад осіб аналізованої групи

    жінки чоловіки
    кількість осіб в аналізованому файлі 101 9
    відсоток 91,8% 8,2%
    Віковий діапазон 33-83. 47-79 р.
    середній вік 64 р. 61р.

    Найвища частота зустрічальності в аналізованій групі була зафіксована у генотипу АА з частотою 74,55%. Ми виявили появу генотипу GG з частотою 4,55%. Генотип АГ виявлений у 20,90% проаналізованих зразків. Згідно із законом Харді-Вайнберга розподіл окремих генотипів знаходився в рівновазі, як це підтверджується результатом тесту на хі-квадрат. Порівнюючи частоти алелів, ми виявили більш високу частоту зустрічальності алелю А в аналізованому наборі, яка траплялася на частоті 0,85. Частота зустрічальності алелю G становила 0,15.

    Вкладка. 2 Частота генотипів та алелів поліморфізму A163G у гені OPG

    Кількість особин Частота генотипів χ 2 Частота алелів
    110 AG AA GG 3.5
    Р = 0,06578    		 A G
    A 82 23 5 0,85 0,15
    З 74,55% 20,90% 4,55%
    Т 79,5 28.05 2.5

    P - значення P, A - абсолютне число, S - спостережувані частоти у відсотках, T - теоретичне число за законом Харді-Вайнберга.

    Отримані результати можна порівняти з результатами досліджень інших авторів, таких як з аналізом Зайчкової та ін. (2008), які в своєму дослідженні проаналізували 165 зразків на наявність поліморфізмів A163G, T245G, G1181C.


    Графік 1. Порівняння відсотків окремих генотипів [6]

    Ніжний та ін. (2002) також звертався до поліморфізму A163G у дослідженні поліморфізму OPG у зв'язку з остеопоротичними переломами. Частота генотипів була такою: AA: 66,5%, AG: 27,9%, GG: 5,6%. У своєму дослідженні вони також аналізували контрольні зразки. Порівняно з остеопоротичною групою, вони зафіксували вищу частоту генотипу АА: 74,4% та меншу частоту гетерозигот АГ: 22,8% та гомозигот ГГ: 2,8%.


    Графік 2. Порівняння геотипів дослідження Bentle L. et al. та наш аналіз [5]

    5. Висновок

    На сьогодні остеопороз є серйозною проблемою для сучасного населення світу. Це величезна проблема охорони здоров'я та соціально-економічна проблема. Витрати, пов'язані з лікуванням остеопорозу, високі. Невеликий відсоток населення повідомляється, що остеопороз вважається цивілізаційною хворобою, яка призводить до швидкого зниження якості життя і в багатьох випадках є причиною смерті. З цих причин краще запобігати цій хворобі, якщо це можливо.

    Ген OPG є одним із "генів-кандидатів" у зв'язку з генетичною схильністю до остеопорозу. Поліморфізми цього гена корелюють з різними фенотипами кісток, включаючи переломи. Ці результати та висновки є лише першим кроком у запобіганні остеопорозу. Запобігти остеопорозу можна правильним способом життя. Важливий спосіб життя тут відіграє важливу роль, це достатнє споживання молочних продуктів та риби, споживання вітаміну D та достатня кількість фізичних вправ.

    Список використаної літератури