Генетично значущі аберації у пацієнтів з мієлодиспластичним синдромом та методи їх виявлення

Анотація:

Мієлодиспластичний синдром (МДС) - гетерогенна група клональних захворювань гемопоетичного кісткового мозку. Захворювання визначається неефективним кровотворенням, диспластичними змінами клітин крові та наявністю цитопенії в периферичній крові. Пацієнти зазвичай старші і приблизно 30% усіх пацієнтів згодом трансформуються в гострий мієлоїдний лейкоз (ОМЛ). Клональні хромосомні аномалії виявляються приблизно у 50% пацієнтів із первинною MDS та у понад 80% пацієнтів із вторинною MDS. На основі специфічних хромосомних відхилень можна прогнозувати прогноз пацієнта, загальну виживаність та відповідне лікування. Ми використовували цитогенетичний аналіз каріотипу, флуоресценцію in situ гібридизацію (FISH) та мультиплексну лігування, залежну ампліфікацію зонда (MLPA) для обстеження пацієнтів та доведення цих відхилень.

пацієнтів

Ключові слова: мієлодиспластичний синдром, хромосомні аберації, діагностика

* Усі таблиці, графіки та малюнки, які є частиною статті, можна знайти у вкладеному PDF-файлі в кінці дослідження.

Причини MDS

Розвиток MDS є багатоетапним процесом, в якому відбуваються зміни в генетичному матеріалі плюрипотентної гемопоетичної стовбурової клітини. Він відрізняється морфологічно та функціонально і набуває переваги у зростанні. Механізм патогенезу MDS в даний час не з’ясований до кінця, вважається, що залучена участь генів, що регулюють ріст, диференціацію та загибель клітин. Змінена клітина проліферує і поступово клони заміщують здорові стовбурові клітини, тим самим послаблюючи або зупиняючи нормальний кровотворення (4). Ми виділяємо два типи МДС - первинний та вторинний. Ми говоримо про первинну, коли причина захворювання невідома. Він становить 85% усіх MDS і в основному вражає людей похилого віку із середнім віком 60-70 років. Захворюваність на первинну MDS зростає в останні роки завдяки кращим методам діагностики, старінню населення та факторам навколишнього середовища (5). Для вторинних MDS (

15%) ми можемо з’ясувати причини захворювання. Може бути декілька таких, як хіміотерапія, променева терапія або вплив токсинів навколишнього середовища (6).

Прогноз захворювання

Перебіг захворювання дуже різний - від найлегших форм із середньою виживаністю кілька років до найважчих форм із виживаністю менше 5 місяців (7). Що стосується прогнозування, існує кілька прогностичних систем, які класифікують пацієнтів за категоріями ризику на основі суміжних ознак (8). В даний час використовується Переглянуто Міжнародна прогностична система підрахунку балів - IPSS-R, який поділяє пацієнтів на 5 категорій ризику відповідно до конкретних параметрів, що вказують на прогностичну значимість, і відповідно до яких проводиться лікування. IPSS-R включає i MDS Cyтогенетична бальна система (табл. 1), який визначає прогностичну групу пацієнта на основі цитогенетичних знахідок у каріотипі (9).

Хромосомні аберації

Хромосомні аберації відіграють важливу роль у патогенезі, прогнозі та діагностиці захворювання. При первинному MDS вони були зареєстровані у 40-60% пацієнтів. У пацієнтів із вторинною MDS зазвичай спостерігається більше змін у генотипі, причому перебудова хромосом спостерігається приблизно до 80-90% (6). Складний каріотип з більш ніж трьома абераціями одночасно спостерігається приблизно у 15% нових MDS проти 50% у вторинних MDS (10).

Найбільш поширені зміни включають del (5q)/- 5, 01507/del (7q), +8, del (20q) a –Y. Непоширені, –17/del (17p)/i (17q), –18/del (18q), +21, +19, inv/t/del (3q), –13/del (13q), –21, t (5q), +11, + 1/+ 1q, del (12p), del (11q), t (7q), + mar та інші (7.11).

Відповідно до сучасних змін у клітинах, ми можемо припустити прогноз захворювання. У пацієнтів з хорошим прогнозом ми виявляємо нормальний каріотип або лише прості зміни. Перебіг захворювання легкий, тривалий з виживанням кілька років, і лікування переважно симптоматичне. Чим гірший прогноз, тим коротший час виживання пацієнтів, різні генетичні зміни і більша ймовірність лейкемічної трансформації (12).

Методи виявлення генетичних змін

1. Цитогенетичний аналіз

Основні методи виявлення аберацій включають цитогенетичний аналіз хромосом. Це дозволяє контролювати чисельні та структуровані реконструкції каріотипу. Великою перевагою методу є можливість досліджувати всі хромосоми одним видом. Недоліком є ​​неможливість ідентифікувати субмікроскопічні зміни нижче межі виявлення методу і водночас потреба в метафазах.

2. РИБНИЙ метод

Флуоресценція in situ гібридизація (FISH) є поширеним методом у цитогенетичних лабораторіях, і її переваги включають можливість аналізу клітин не тільки в метафазі, але і в інтерфазі, коли культура клітин не потрібна. Ще однією перевагою є швидкий аналіз великої кількості клітин. Водночас це дозволяє виявити аберації приблизно в 15% цитогенетично негативних випадків і допомагає прояснити складні реконструкції. Обмежуючим фактором методу є можливість ідентифікувати лише ті ділянки ДНК, в яких використовуються зонди. Для відповідного виявлення у зразку повинно бути принаймні 1-5% аберрантних міжфазних ядер.

Таблиця 1. Цитогенетична бальна система MDS (9, модифікована)

3. Аналіз MLPA

Як і FISH, метод мультиплексного лігування залежною ампліфікацією зонда (MLPA) використовує зв'язування олігонуклеотидних зондів з цільовою послідовністю ДНК на основі їх комплементарності. На відміну від FISH, цей метод здатний ідентифікувати більше 40 різних послідовностей ДНК в одній реакції (13). Зонди, що використовуються в методі MLPA, мають меншу довжину (50 - 70 bp) і дозволяють чутливо виявляти інші клінічно значущі аномалії MDS з меншою частотою. Перевагою MLPA є диференціація послідовностей, які відрізняються одна від одної різницею в одному нуклеотиді. Недоліком методики є необхідність мати принаймні 30% мутованих клітин у зразку для надійного виявлення відхилень (14).

Метою нашої роботи було:

  1. Створити та проаналізувати набір пацієнтів з діагнозом MDS, обстежених у нашому генетичному відділенні в період з лютого 2016 року по квітень
  2. Визначити наявність хромосомних аберацій, охарактеризувати їх, визначити їх частоту в групі та розділити пацієнтів за наявними абераціями.
  3. Оцініть взаємозв'язок між результатами тесту та прогнозом.
  4. Визначити внесок окремих методів у оцінку аберацій хромосом та порівняти успіх застосовуваних методів - класичної цитогенетики, методу FISH та методу

Популяція пацієнтів та методи

Ми зарахували пацієнтів з діагнозом MDS, які проходили обстеження в нашій генетичній лабораторії з лютого 2016 року по квітень 2018 року. Критерієм зарахування пацієнта був діагноз, поставлений лікарем за запитом. Ми проаналізували загалом 620 зразків пацієнтів, з них 383 - зразки кісткового мозку (KD) та 237 - зразки периферичної крові (PK). У цій роботі ми використовували такі методи: цитогенетика, FISH та MLPA.

Препарати для аналізу каріотипу готували культивуванням клітин KD у повному середовищі протягом 24 годин та обробляли за стандартними процедурами. У 360 пацієнтів було проаналізовано 20 метафаз, якщо це можливо, і цитогенетичні позначення визначали згідно з ISCN (Міжнародна система номенклатури хромосом). У методі FISH в якості вихідного матеріалу використовували культивований KD та/або PK пацієнта, приготований безпосередньою обробкою. Згодом відбулася гібридизація з відповідним зондом та оцінка препаратів під флуоресцентною мікроскопією. Всього було оцінено 521 зразок, 380 KD і 141 PK. В якості вихідного матеріалу для аналізу MLPA була виділена ДНК із зразка KD та/або PK, що постачається в EDTA. Набір SALSA MLPA P414-B1 MDS probemix (MRC - Holland) використовували для аналізів для виявлення 46 специфічних хромосомних областей з продуктами ампліфікації від 122 до 469 нуклеотидів. Зонди призначені для найбільш поширених і прогностично значущих аберацій у MDS згідно з IPSS-R. Цей метод обстежив 398 пацієнтів (214 КД та 184 ПК).

Результати

1. Характеристика та аналіз групи пацієнтів

Набір включає зразки кісткового мозку або периферичної крові від 620 пацієнтів і складається з 289 (46,6%) пацієнтів чоловічої статі та 331 (53,4%) пацієнтів жіночої статі. Середній вік пацієнтів на момент постановки діагнозу становив 69 років з віковим діапазоном від 13 до 93 років. Пацієнти, обстежені за зразком кісткового мозку, мали патології в 36% випадків, пацієнти, оглянуті за зразком периферичної крові, лише у 14% випадків.

1. Частота хромосомних аномалій

За результатами зразків кісткового мозку 383 пацієнтів, які були обстежені цитогенетично, FISH та/або MLPA, ми охарактеризували та згодом визначили виникнення найпоширеніших відхилень. Ми виявили 287 хромосомних аберацій, принаймні двох методах, що використовувались для обстеження у 99% пацієнтів. Графік показує індивідуальне представлення аберацій як ізольованих відхилень у геномі та як відхилень, що мали місце в поєднанні з іншими патологіями.

2. Визначення прогнозу пацієнтів

Прогноз та медіана виживання 383 пацієнтів визначали, використовуючи результати тестів з аналізів зразків кісткового мозку, отриманих за допомогою цитогенетики, FISH та/або MLPA. Оцінювали представництво окремих пацієнтів у прогностичних групах та їх загальну виживаність.

Ми розрахували медіану виживання статистичним методом Каплана-Мейєра разом для 351 пацієнта, у якого ми мали доступну інформацію про виживання, відповідно. смерть. Ми успішно визначили медіану в групах: середня, погана та дуже погана. У дуже хороших і хороших групах пацієнти мали вищу виживаність, і за їх прогнозом ймовірність виживання не опускалася нижче 0,5 (50%). Тому ми не отримали відповідних даних, оскільки значна частина пацієнтів все ще жива. Графічний малюнок демонструє, що при гіршому прогнозі виживання пацієнтів також зменшується. В у таблиці 3 є узагальненням даних за окремими групами ризику. Показано кількість пацієнтів у групах, кількість смертей та тих, хто живе в групі, та відсоток виживання групи.

3. Визначення успіху використовуваних методів

80 пацієнтів були обстежені одночасно за всіма трьома методами. Цей файл був використаний для порівняння успішності використовуваних методів. Ми порівняли кількість успішних аналізів окремих методів, які підтвердили принаймні один хроаналіз. Це виявилося найбільш чутливим методом виявлення наявності аберацій. Аналіз каріотипу був позитивним у 60 (75%) випадках. Метод скринінгу MLPA продемонстрував порівнянний успіх з цитогенетичним аналізом. Вона зафіксувала позитивний результат у 59 (74%) пацієнтів.

Обговорення

MDS - це захворювання переважно людей похилого віку з медіаною 70 років на момент постановки діагнозу, групу до 50 років складають:

10% пацієнтів (2). У нашому дослідженні середній вік становив 69 років, а кількість пацієнтів до 50 років становила 15%. Захворюваність на MDS швидко зростає з віком старше 60 років. Грінберг та співавт. (9) повідомляють, що до 77% пацієнтів старші 60 років на момент постановки діагнозу. У нашій роботі пацієнти старше 60 років становили 74%.

Для стандартних аналізів використовували 383 зразки кісткового мозку та 237 зразки периферичної крові. Пацієнти, оглянуті за зразком кісткового мозку, мали патології у 138 (36%) випадках, пацієнти, які досліджувались за зразком периферичної крові, лише у 34 (14%) випадках. Виявлення патологій у кістковому мозку пацієнтів повідомлялося в літературі в діапазоні від 37 до 55% (9,11,12). Інші пацієнти мали негативний результат. Дослідження для виявлення відхилень у цілій периферичній крові відсутні. На основі наших результатів ми можемо стверджувати, що кістковий мозок є більш придатним біологічним матеріалом для аналізу, ніж периферична кров. Тут виникає саме захворювання, спостерігається більший рівень захворюваності на патологічні клітини, а отже, і більше виявлення аберацій.

Причиною того, що ми отримали нижчі середні значення виживання та не досягли результатів для груп з дуже хорошим та хорошим прогнозом, може бути короткий період спостереження. Наші результати підтвердили, що загальна виживаність пацієнтів скорочується в міру погіршення прогнозу.

Ми також порівняли успіх використовуваних діагностичних методів. Ми оцінили групу пацієнтів, які обстежувались усіма трьома методами одночасно. Пацієнти не могли мати негативних результатів, і методи повинні були виявити принаймні одну аномалію. Показано, що метод FISH є найбільш чутливим для виявлення наявності патологій. У 85% випадків вона успішно виявила патологію. FISH має високу чутливість і специфічність для цільової області в ДНК. Він виявляє відхилення з роздільною здатністю від 100 кб до 1 Мб, але фіксує лише область хромосоми, в якій використовується зонд. Аналіз каріотипу (75%) та метод MLPA (74%) показали порівнянний успіх. Аналіз каріотипу фіксує числові та структурні аберації відразу на всіх хромосомах до межі виявлення близько 5 Мб і обмежується невдалим культивуванням клітин у середовищі (20).

У той же час метод MLPA дозволяє проводити скринінг 46 конкретних областей, які також включають менш часто зустрічаються патології MDS. Однак його обмеження полягає в тому, що він не може вловлювати збалансовані генетичні перебудови і потребує принаймні 25-30% уражених клітин у зразку (21).

Висновок

В даний час захворюваність на МДС розвивається в Європі і, як очікується, зростатиме на 25 000 нових випадків щороку. Причиною є не тільки старіння населення, а й збільшення забруднення навколишнього середовища. Тому точна діагностика пацієнтів, правильне визначення прогнозу та подальша постановка відповідної терапії дуже важливі. Сьогодні для діагностики аберацій використовуються стандартні генетичні методи, такі як цитогенетичне дослідження каріотипу, метод FISH та аналіз MLPA, кожен з яких має своє унікальне місце, і їх взаємне поєднання гарантує захоплення якомога більшої кількості аберацій у геномі хворий на МДС.