метилтрансферази

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Хетоцин покращував прогноз у щурів, чутливих до солі Даля (ДС) із серцевою недостатністю
  • Хетоцин відновив знижену регуляцію мітохондріальних генів, пов'язаних із серцевою недостатністю
  • Хетоцин покращував дихання мітохондрій та збільшував вміст мітохондрій у серцях, що не працюють
  • Серцева недостатність підвищувала рівень H3K9me3 на рецидивуючих елементах, і цей ефект був зворотним після лікування хетоцином.
  • Хетоцин знижував рівень H3K9me3 на повторах інтрону Pgcla
  • GO-аналіз повторюваних локусів H3-up H3K9me3 із зворотною реакцією на хетоцин
  • обговорення
  • Матеріали і методи
  • Доставка тварин та наркотиків
  • Артеріальний тиск та ехокардіографічні дослідження
  • Морфометричний аналіз
  • Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (ПЛР)
  • ДНК мікрочипів
  • Чіп
  • секвенування
  • Зміна рівня H3K9me3 на повторюваних елементах
  • Виділення мітохондрій серця
  • Потреба мітохондрій у кисні
  • Вміст білків мітохондрій та ДНК
  • Статистичний аналіз
  • Зберігання даних
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Зупинка серця
  • Посттрансляційні модифікації гістону

реферат

Ацетилювання гістону пов’язане з гіпертрофією серця та серцевою недостатністю. Однак патологічні наслідки змін метилювання гістону та наслідки втручань з інгібіторами гістону метилтрансферази на серцеву недостатність не з’ясовані до кінця. Ми зупинились на стані H3K9me3 в серці та дослідили вплив інгібітора гістетину H3K9 метилтрансферази хаетоцину на прогноз у чутливих до солі щурів Даля, тваринна модель хронічної серцевої недостатності. Хетоцин продовжував виживання та відновлював дисфункцію мітохондрій. Аналіз ChIP-seq показав, що хронічний серцевий стрес викликав збільшення H3K9me3 у тисячах повторів, включаючи інтронні ділянки генів, пов'язаних з мітохондріями, таких як ген, що кодує рецептор, що активується проліфератором пероксисоми, гамма-альфа. Крім того, хетоцин змінив цей ефект на цих місцях повторення. Ці дані дозволяють припустити, що надмірна гетерохроматинізація повторюваних елементів мітохондріальних генів у серцевій недостатності може призвести до заглушення генів та порушення серцевої функції. Таким чином, хетоцин може бути потенційним терапевтичним засобом при хронічній серцевій недостатності.

Серцева недостатність є однією з основних причин смерті у всьому світі 1, 2. Хоча існуючі методи лікування серцевої недостатності, спрямовані на ренін-ангіотензин-альдостерон та адренергічну нервову систему, ефективні 3, 4, 5, 6, 7, смертність від серцевої недостатності залишається високою 1, 2, 8. Для розробки більш ефективної терапевтичної стратегії необхідні нові знання про механізми, що лежать в основі захворювання. Мітохондрії та метаболічна функція спрямовані на лікування серцевої недостатності, оскільки вони мають важливе значення для виробництва енергії міокарда, окислювально-відновного потенціалу, активних форм кисню (АФК), апоптозу, залежного від мітохондрій, гомеостазу кальцію та метаболізму жирних кислот та глюкози.

Патологічна гіпертрофія та серцева недостатність пов'язані зі зміненою експресією багатьох генів 9, 10, 11, 12, 13. Асакура та ін. стверджує, що багато генів серцевої недостатності беруть участь у шляхах функції мітохондрій, окисного фосфорилювання та позаклітинної сигналізації 14. Епігенетичні зміни відіграють важливу роль у регуляції транскрипційної активності. Модифікації гістонів можуть змінити структуру хроматину, щоб вплинути на доступ фактора транскрипції до ДНК та рекрутинг комплексів транскрипції до областей промотору/енхансеру генів 15. Відомо, що ацетилювання та деацетилювання гістону відіграють певну роль у розвитку серцевої гіпертрофії та серцевої недостатності 16, 17. Крім того, інгібування активності гістондеацетилази (HDAC) запобігає переробці серця 18. Інгібітори HDAC, ймовірно, матимуть багато механізмів дії 19, включаючи інгібування серцевої гіпертрофії 20, 21, аутофагу 22, апоптоз 23, серцевий фіброз 24, 25, запалення 26, 27 та регуляцію скорочення серця 28 .

Раніше ми показали, що хромосомний розподіл триметилування гістону Н3 лізину 9 (H3K9me3) та триметилювання літозину 4 (H3K4me3) гістону Н3 відрізняється від розподілу ацетилювання гістону між нормальною та серцевою недостатністю на тваринних моделях серцевої недостатності 29. Подальші дані свідчать про те, що метилювання гістону в лізині 4 (К4), К9 або К36 гістону Н3 бере участь у реконструкції серця 30, 31, 32, 33. Отже, і метилювання гістону, і ацетилювання гістону можуть виступати терапевтичними мішенями при лікуванні серцевої недостатності.

H3K9me3 пов’язаний з утворенням гетерохроматину і необхідний для визначення перицентромерних та теломерних областей 34. Зміни рівнів H3K9me3 на різних геномних ділянках, включаючи супутникові повтори та повторювані транспонуючі елементи, також пов'язані з реакцією на рак та стрес 35, 36. Однак, ні роль H3K9me3 у рецидивуючих локусах у серцевій недостатності, ні ефективність інгібіторів гістону метилтрансферази при серцевій недостатності не з’ясовано.

Отже, у цьому дослідженні ми вивчили стан триметилювання H3K9 на повторюваних елементах у серцевій недостатності та припустили, що модифікуючий гістон фермент, що впливає на стан триметилювання H3K9, може відігравати важливу роль у серцевій недостатності. SU (VAR) 3-9 - це фермент, який каталізує перетворення K9 в гістоні Н3 з диметильованої форми в триметильовану. Хетоцин, природна невелика молекула, що виробляється грибами виду Chaetomium 37, є інгібітором SU (VAR) 3-938. Таким чином, ми дослідили, чи блокує цей інгібітор метилтрансферази H3K9 прогресування серцевої недостатності на тваринній моделі. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що хетоцин затримував перехід від гіпертрофії до серцевої недостатності, відновлював мітохондріальну дисфункцію в непрацездатних серцях і продовжував виживання тварин.

результат

Хетоцин покращував прогноз у щурів, чутливих до солі Даля (ДС) із серцевою недостатністю

Незважаючи на те, що вміст мітохондріальної ДНК не відрізнявся між контрольною групою та групою HF, суттєве збільшення вмісту мітохондріальної ДНК спостерігалося після обробки хетоцином (рис. 2С). Експресія гена, що кодує гамма-рецептор, що активується проліфератором пероксисоми, коактиватор 1 альфа (Pgcla), який відіграє важливу роль у біогенезі мітохондрій та у виробництві енергії, значно збільшилася після введення хетоцину (рис. 2D). Ці висновки дозволяють припустити, що хаетоцин покращував дихання мітохондрій, зумовлене підвищеним вмістом мітохондріальної ДНК та експресією Pgcla у серцях, що не працюють.

Серцева недостатність підвищувала рівень H3K9me3 на рецидивуючих елементах, і цей ефект був зворотним після лікування хетоцином.

Щоб вивчити стан H3K9me3 у всьому геномі, включаючи повторювані елементи в серці, ми провели імунопреципітацію хроматину (ChIP), щоб проаналізувати послідовності, що демонструють H3K9me3 у невдалих ЛШ з лікуванням хетоцином та без нього. У 6550 локусах, пов’язаних з повторюваними елементами, серцева недостатність спричинила збільшення вирівнювання H3K9me3 порівняно з контролем. Ми визначили ці елементи як "високочастотні". Дев'яносто дев'ять відсотків локусів HF-up, тобто 6534 повтори, показали відповідне зниження H3K9me3 у відповідь на лікування хетоцином. На відміну від цього, у 335 локусах ми спостерігали зниження рівня вирівнювання H3K9me3 у серцевому западі у порівнянні зі зменшенням у контрольних групах. Ми визначили ці елементи як "HF-вниз". Введення інгібітора змінило цей ефект у 10,4% цих ВЧ-локусів, тобто 35 повторів (рис. 3А). Таким чином, HF підвищував рівні H3K9me3 на повторюваних елементах, а хаетоцин змінював рівні H3K9me3 у цих локусах, як очікувалося, на основі інгібуючої активності метилтрансферази H3K9 у серцевих тканинах.

( A ) Кількість повторюваних елементів, для яких серцева недостатність спричинила збільшення (ВЧ-вгору) або зменшення (ВЧ-вниз) у H3K9me3 порівняно з контролем (ліворуч). Відсоток відновлення триметилювання H3K9 після лікування хетоцином (праворуч). ( B ) Рівні H3K9me3 в зонах повторення інтронів Pgcla. Червоні квадрати означають область, яка була визначена збагаченою для елементів повторення H3K9me3 у щурів із серцевою недостатністю. Чорні ящики позначають місця, що повторюються. У стовпцях вказується вирівнювання зчитування повторюваних елементів H3K9me3. RPM, виміряні значення на мільйон.

Повнорозмірне зображення

Хетоцин знижував рівень H3K9me3 на повторах інтрону Pgcla

У цьому дослідженні ми зосередилися на геномних регіонах, що знаходяться в безпосередній близькості від генів RefSeq. Два повторювані локуси в інтроні Pgcla показали підвищений рівень H3K9me3 у серцевій недостатності, і цей ефект був придушений лікуванням хетоцином (рис. 3B). Інші місця повторення, що демонструють підвищений рівень H3K9me3 у серцевій недостатності, включали кілька геномних областей, розташованих в безпосередній близькості від мітохондріальних генів. Наприклад, ми ідентифікували такі генні регіони: ацил-КоА дегідрогеназний інтрон, середній ланцюг, Acadm (рис. 4А); дві області інтронів білка Fe-S NADH-убихінону оксидоредуктази 4, Ndufs4 (рис. 4В); і область інтрону для гексапренілдігідроксибензоату метилтрансферази, попередник мітохондрій, Coq3 (додаткова фігура 2). Відповідно до епігенетичного профілю H3K9me3, рівні мРНК Acadm та Ndufs4 були взаємно найнижчими у серцевій недостатності, як визначали кількісною ПЛР у реальному часі. Хоча відновлення мРНК Coq3 при лікуванні не було значним, підвищений рівень H3K9me3 у серцевому стані, що не працює, порівняно з контрольним серцем, можливо, сприяв зменшенню експресії Coq3. .

Далі ми припускаємо, що різниця між повною зміною H3K9me3 у відповідь на хетоцин у повторюваних елементах Pgc1 та меншим відновленням експресії гена Pgc1a може бути пояснена появою H3K9me3 та іншими епігенетичними модифікаціями під час прогресування та розвитку гіпертрофії. зупинка серця. Наприклад, деацетилювання гістону та метилювання ДНК можуть відбуватися в промоторній області. Подальше введення інгібітора HDAC може бути більш ефективним для відновлення експресії мРНК до базальних рівнів.

Матеріали і методи

Доставка тварин та наркотиків

Усі експерименти на тваринах у цьому дослідженні були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин в Університеті Кейо (09088) та проводились відповідно до Інституційних вказівок для експериментів на тваринах Університету Кейо. П’ятитижневі самці щурів DS були придбані у Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Токіо, Японія). Щурів розділили на чотири групи: контрольна [нормальна сольова дієта, що містить 0,3% NaCl, NS (-)], нормальна сіль з хетоцином [0,25 мг/кг хетоцину (Sigma-Aldrich Co. LLC, Сент-Луїс), Міссурі, США ), NS (ch +)], HF [дієта з високим вмістом солі, що містить 8% NaCl, HS (-)] та лікування [дієта з високим вмістом солі з 0,25 мг/кг хетоцину, HS (ch +)] групи, Chaetocin розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО). Щурам у групі лікування вводили 0,25 мг/кг хетоцину внутрішньочеревно двічі на тиждень з 6-тижневого віку до 13-тижневого віку, як описано раніше 46. Тварин приносили в жертву, а тканини зберігали відповідно до кожного експерименту.

Артеріальний тиск та ехокардіографічні дослідження

Рівні артеріального тиску вимірювали через 5, 8, 10 і 13 тижнів методом хвостової манжети (BP-98 AL; Softron, Токіо, Японія). Серця щурів віком 13 тижнів оцінювали за допомогою ехокардіографії з використанням VisualSonics (Vevo 2100; VisualSonics Inc.). Детальні процедури вимірювання артеріального тиску та ехокардіографічна оцінка наведені в додаткових методах.

Морфометричний аналіз

Серцеву тканину фіксували у формаліні, вкладали у парафін і розрізали на ділянки товщиною 5 мкм. Зрізи фарбували гематоксилін-еозином або EvG та пікросіріусом червоним для вивчення морфології та виявлення серцевого фіброзу. Для оцінки кількості колагенових волокон зрізи спостерігали за допомогою флуоресцентного мікроскопа (BZ-9000; KEYENCE Japan Inc., Осака, Японія). Об'ємну частку фіброзу оцінювали як загальну площу фіброзу (обчислену системою підрахунку клітин), поділену на загальний об'єм ЛШ, помножений на 100.

Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (ПЛР)

Дволанцюгова кДНК була синтезована з 2 мкг РНК і піддана ПЛР за допомогою TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) та заздалегідь розроблених генно-специфічних праймерів та зондів (TaqMan Gene Expression Assays: Applied Biosystems) . Детальні процедури кількісної ПЛР у реальному часі наведені в додаткових методах.

ДНК мікрочипів

РНК виділяли із зразків ЛШ у щурів із серцевою недостатністю за допомогою mirVana (Applied Biosystems), згідно з інструкціями виробника. Суміш РНК із трьох вибірково вибраних у кожній групі зразків використовували для аналізу експресії геному у всьому геномі за допомогою чіпа Rat Oligo 20 K (TORAY). Онтологічний аналіз генів проводили за допомогою GeneCodis3 (// genecodis.cnb.csic.es/) 47, 48, 49 .

Один грам тканини ЛШ на групу наносили на ChIP з 25 мкг антитіла (націленого на триметильований гістон K4 H3 [# 8580; Abcam, Токіо, Японія) або триметильований гістон K9 H3 [# 07-442; Millipore, Темекула, Каліфорнія, США]) або 1 мкг кролячого IgG (# 2729; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Детальні процедури для ЧІП наведені в Додаткових методах. У цій статті повідомляється лише про результати ChIP щодо триметильованого K9 гістону H3.

секвенування

Зразки осаджених фрагментів ДНК були додатково фрагментовані перед аналізом послідовності (HiSeq 2000). Хроматин, імунопреципітований (ChIP'd), геномну ДНК з кожної групи та вхідну ДНК секвенували згідно з інструкціями виробника (Illumina). Детальніше про вирівнювання зчитування наведено в додаткових методах.

Зміна рівня H3K9me3 на повторюваних елементах

Ми вирівняли значення H3K9me3-ChIP’d з геномними властивостями, склавши геном щура rn4 та базу даних повторів щурів з UCSC RepeatMasker. Якщо відношення кількості нуклеотидів, що перекриваються між повторюваними елементами та секвенуваними даними, до мінімальної кількості нуклеотидів у повторюваних елементах або в послідовному зчитуванні становило 90% і більше, ми вважали це "перекриттям". На повторюваних елементах ми виявили збагачені H3K9me3 регіони, що мають 100-кратні відмінності в H3K9me3 порівняно з вхідною ДНК.

Виділення мітохондрій серця

Мітохондрії були свіжоізольовані з 13-тижневого серця, як описано раніше 50. Більш детальна інформація наведена в додаткових методах.

Потреба мітохондрій у кисні

Споживання кисню в мітохондріях (дихання мітохондрій) вимірювали електродом Кларка O2 з використанням кисню Meter Model 781 та закритою дихальною камерою Mitocell MT200 (Strathkelvin Instruments) при 37 ° C, як описано раніше 50, 51. Більш детальна інформація наведена в додаткових методах.

Вміст білків мітохондрій та ДНК

Концентрації білка у фракціях мітохондрій вимірювали за допомогою аналізів білка BCA. Мітохондріальну ДНК, виділену з серця, аналізували за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу, використовуючи Thermal Cycler Dice TP800 системи реального часу (Takara Bio Inc., Shiga, Японія). Всі зразки нормалізували на вміст геномної ДНК. Послідовності праймерів та зондів для кожної ПЛР наведені в додатковій таблиці 2.

Статистичний аналіз

Кумулятивні показники виживання щурів у різних групах порівнювали за допомогою лог-рангових тестів. Усі результати представлені у вигляді середніх значень та стандартних відхилень (SD). Статистичне порівняння проводили, використовуючи односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з поправками після Бонферроні на малюнках 1A-D та 4 та пост-hoc поправками Даннета на малюнках 2B-D.

Зберігання даних

Дані мікрочипів та ChIP-seq зберігаються в GEO під номерами приєднання GSE66617 та GSE69194.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Ono, T. et al. Інгібітор гістону 3 лізину 9 метилтрансферази хаетоцин покращує прогноз на щурячій моделі серцевої недостатності, спричиненої дієтою з високим вмістом солі. Наук. Респ. 7, 39752; doi: 10, 1038/srep39752 (2017).

Примітка видавця: Природа Спрінгера залишається нейтральною щодо вимог юрисдикції в опублікованих картах та інституційних асоціаціях.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.