Університет Гранади Інститут біотехнологій Керована науково-дослідна робота для отримання звання: магістр біотехнології Характеристика білкового профілю ентомопатогенного штаму Bacillus pumilus. Діана Кароліна Гарсія Рамон Липень 2011

білків допомогою

Університет Гранади Інститут біотехнологій Керована дослідницька робота для отримання звання: Магістр біотехнології Характеристика білкового профілю ентомопатогенного штаму Bacillus pumilus. Діана Кароліна Гарсія Рамон, липень 2011 р. Викладач: співавтор: драматург Сузана Вільчес Торнеро найнятий професор доктор кафедри біохімії Інститут біотехнологій Університету Гранади доктор Антоніо Осуна Каррілло де Альборноз професор Університету Гранади Департамент паразитології Університету Гранади

Частина результатів цієї дослідницької роботи була представлена ​​на 13-й Європейській зустрічі Конгресу робочих груп IOBC/WPRS усною презентацією під назвою: Розуміння токсичності Bacillus pumilus 15.1 щодо середземноморської плодової мухи (Ceratitis capitata). Місце проведення: Інсбрук, Австрія Дата: 19-23 червня 2011 р

ПОДЯКИ ІНДЕКСУ. Я ПОКАЗНИК. V РЕЗЮМЕ. 1 СКОРОЧЕННЯ. 5 1. ВСТУП. 9 1.1 Ентомопатогенні мікроорганізми. 11 1.2 Ентомопатогенні бактерії. 13 1.2.1 Рід Bacillus. 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis. 15 1.2.2.1 Фактори вірулентності: токсини Cry та Cyt. 17 1.2.2.2 Інші фактори вірулентності. 19 1.2.2.3 Біотехнологічні програми. 21 1.3 Bacillus pumilus. 22 1.3.1 Біологія. 22 1.3.2 Біотехнологічні програми. 24 1.3.2.1 Виробництво ферментів. 1.3.2.2 Виробництво антибіотиків. 26 1.3.2.3 Біологічний контроль. 27 1.3.2.3.1 Боротьба з грибами та бактеріями в рослинах. 27 1.3.2.3.2 Боротьба з комахами. 30 1.3.2.4 Інші програми. 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1. 32 2. ЦІЛІ. 37 3. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ. 43 3.1 Умови культури штамів бактерій. 45 3.1.1 Штами бактерій та їх збереження. 45 3.1.2 Культурні середовища. 46 3.1.2.1 Багате середовище. 46 3.1.2.2 Середовище спороношення. 46 3.1.3 Умови вирощування. 47 3.2 Аналіз білка. 47 3.2.1 Обробка зразків білка. 47 3.2.2 Електрофорез білків. SDS-PAGE. 49 3.2.3 Поділ білків за допомогою сахарозного градієнта. 50 3.2.4 Мікроскопія. 51 3.2.4.1 Оптична мікроскопія. 51 3.2.4.2 Трансмісійна електронна мікроскопія. 52 3.2.5 Імуноблоти. 52 3.2.6 Розчинення білка. 54

3.2.7 Аналіз та ідентифікація білків за допомогою MALDI-TOF. 56 3.2.8 Біопроби на C. capitata. 56 3.2.8.1 Утримання колонії середземноморських плодових мух. 56 3.2.8.2 Біопроби з личинками. 58 4. РЕЗУЛЬТАТИ. 63 4.1 Білковий профіль штаму B. pumilus 15.1. 65 4.1.1 Білковий профіль вегетативної культури. 66 4.1.2 Білковий профіль спороносної культури. 67 4.2 Поділ білка за допомогою градієнтів сахарози. 70 4.3 Спостереження за B. pumilus 15.1 за допомогою мікроскопії. 79 4.4 Аналіз фракцій культури B. pumilus 15.1 за допомогою імуноблоту. 85 4.5 Солюбілізація білка. 88 4.6 Ідентифікація білків за допомогою аналізу слідів пептидів або відбитків пальців. 4.7 Активність ізольованих білків у градієнтах сахарози проти личинок C. capitata. 95 5. ОБГОВОРЕННЯ. 99 6. ВИСНОВКИ. 109 7. МАЙБУТНЯ РОБОТА. 115 8. БІБЛІОГРАФІЯ. 121 ДОДАТКИ. 141 Аналіз та ідентифікація білків за допомогою MALDI-TOF. 143 37 кда білка. 143 Білок 17 кда. 144 Білок 45 кда. 145 Білок 60 кда. 146 Білок 250 кда. 147

СКОРОЧЕННЯ (p/p) Співвідношення вага/вага (p/v) Співвідношення маса/об'єм (v/v) Співвідношення об'єм/об'єм

Приблизні C градусів Цельсія мкг Мікрограми мкл Мікролітри мкм Мікрометр 16S Прокаріотична рибосома мінорна субодиниця молекула рРНК ДНК Дезоксирибонуклеїнова кислота APS Амоній персульфат РНК Рибонуклеїнова кислота рРНК рибосомна РНК АТФ Аденозин трифосфат білка, англійський кристал білтінг Кристал Біт Англійська Кристал Кристал Біт Англійський Кристал Біт. Цитолітичний білок Da Daltons ДНКаза Дезоксирибонуклеаза DTT Дітріотреітол EDTA Етилендіамінтетраоцтова кислота g Грами H 2 O 2 Перекис водню HCl Соляна кислота K 2 MnO 4 Марганат калію kb Кіло основи 5

kda LM ma mg ml mm mm MS - MS PBS ph PMSF RNase rpm SDS SDS-PAGE TEMED CFU V Vh W xg Kilo Daltons Liter Молярна концентрація Мілі ампер Мілі грам Мілі лі Мілі метр Мілі Молярний Метод фрагментації пептидів у мас-спектрометрії Буфер Сольовий фосфат Водневий потенціал Фенілметилсульфонілфторид Революція рибонуклеази в хвилину Додецилсульфат натрію Додецилсульфат натрію поліакриламід гель електрофорез N, N, N, N-тетраметилетилендіамін Колонієутворюючі одиниці Вольт Відносна англійська напруга залу Ват або Ват сила Відносна відцентрова відцентрова сила

1. ВСТУП 9

Вступ ABCDEFF Рисунок 1.1 Різна морфологія параспоральних кристалів: ромбоподібний (A), дипірамідний (B), гетерогенний (C) (Kaelin et al. 1994), сферичний (D), неправильний (E) (Karamanlidou et al. 1991) та кубічний (F) (Рамалакшмі та Удаясуріян 2010). 1.2.2.1 Фактори вірулентності: токсини Cry і Cyt Група δ-ендотоксинів складається з двох груп білків, які не мають послідовності або третинної структури, гомологічної між собою: білки Cry (від англійського Crystal) та білки Cyt ( з англійської Cytolitic). На сьогоднішній день було клоновано та секвенсовано 572 різних гена криків та 35 генів cyt (Crickmore et al. 2011). Кожен δ-ендотоксин має характерний спектр інсектицидної активності, діапазон дії якого обмежений кількома видами, як правило, одного порядку. Цей спектр може залежати від комбінації δ-ендотоксину, яку виробляє штам. Описано велику кількість комбінацій генів δ-ендотоксину, найбільше з яких - 17

з тими ж характеристиками є B. pumilus T4, який індукує резистентність у Arabidopsis проти Pseudomona syringae (Ryu et al. 2003). Механізм дії деяких штамів B. pumilus на індукцію систем резистентності у рослин досить добре вивчений. Наприклад, у цукрових буряків В. pumilus 203-6 та 203-7 індукують системну стійкість, збільшуючи вироблення хітинази та β-1,3-глюканази (Bargabus et al. 2004); У тютюну стійкість, опосередкована B. pumilus SE34, визначається підвищеним рівнем саліцилової кислоти (Zhang et al. 2002), тоді як у гороху цей самий штам викликає резистентність шляхом зміцнення клітинних стінок епідермісу та кортикальної тканини за рахунок виробництва калози та фенолу сполуки (Choudhary and Johri 2009). Таким чином, індукція системної резистентності у рослин B. pumilus, як і інших видів, залежить від штаму бактерій, рослини-хазяїна, а в деяких випадках і збудника (Choudhary and Johri 2009). Кілька прикладів описано в літературі (табл. 1.2). Ця програма була промислово експлуатована, і на продаж є кілька продуктів, діючою речовиною яких є штам B. pumilus (табл. 1.3). 28

Вступ Таблиця 1.2 Використання B. pumilus для біологічного контролю рослинних патогенів. Bacillus pumilus Штам Рослинна хвороба Збудник 203-6 та 203-7 Цукровий буряк Листя плями Cercospora Cercospora beticola SE34 та T4 Тютюн Синя цвіль Peronospora hyoscyami pv. tabacina INR7 Огірок Бактеріальне в'янення Erwinia tracheiphila SE34 Томатний листок плямистий Огірковий мозаїчний вірус (CMv) SE34 Томатний пізній гриб Phytophthora infestans INR7, SE34, SE39, SE52 Пахощі соснові Веретеноподібна іржа Cronartium quercuum, Miyabe exsirai f. sp. Fusiform INR7 Огірок Кутова пляма Pseudomona syringae SE34 Томатний лист плямистий T4 Тютюн Wildfire Томатний плямистий вірус (ToMov) Pseudomona syringae pv. тютюн Джерело: (Choudhary and Johri 2009). 29

Таблиця 1.3 Комерційні продукти для біологічного контролю в рослинах на основі марки B. pumilus Марка/найменування продукту Штам B. pumilus Збудник/хвороба GB34 Біологічний фунгіцид GB34 Ризоктонія та фузаріозна балада QST2808 Соєва іржа з ​​Азії Соната B. pumilus Борошниста роса, цвіль, листя плями Cercospora, ранній напад, фітофтороз, бура гниль, вогняний напад. Щит врожайності GB34 Патогенні гриби, що викликають захворювання коренів. Джерело: Комітет з біологічного контролю APS (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/) 1.3.2.3.2 Боротьба з комахами Традиційно В. pumilus не вважається ентомопатогенним видом. Незважаючи на велике розмаїття корисної біологічної діяльності, яке було продемонстровано, його застосування зосереджено на застосуванні біоплагіцидів для профілактики та лікування захворювань, спричинених фітопатогенними грибами, головним чином у коренях деяких культур. Однак дослідження демонструють патогенність штамів B. pumilus щодо комах-мішеней (Heins et al. 1999; Eryurk et al. 2008; Molina et al. 2010; Yaman et al. 2010). 30

Вступ У 1999 р. Хайнс та ін. Запатентували метод захисту рослин від кукурудзяного хробака (Diabrotica virgifera, D. longicornis, D. undecimpunctata), зеленого пончикового або бурякового хробака (Spodoptera exigua) та деяких видів нематод шляхом застосування певна кількість надосадової рідини, отриманої з повної культури B. pumilus AQ717, на будь-якій частині рослини, включаючи коріння або нанесення на навколишній грунт. Зазначений патент включає штам B. pumilus AQ717, метаболіти з пестицидною активністю, що виробляються штамом, та різні методи захисту та обробки рослин проти цих комах, або за допомогою суспензії бактеріальної культури, супернатанту культури або очищеного метаболіту. Патент описує виробництво низькомолекулярного розчинного і токсичного метаболіту (