предметів

реферат

Мікробіоз кишечника взаємодіє з фізіологією господаря через багато передбачуваних метаболічних та регуляторних шляхів, які впливають на здоров’я та захворювання 1, 2. Мікробіоз бере участь у розвитку ожиріння, спричиненого дієтою, але основні механізми не з’ясовані до кінця 3, 4 .

Клітковина захищена від розвитку ожиріння, спричиненого дієтою 5, 6, 7. Ефекти клітковини значною мірою пояснюються їх ферментацією кишковими бактеріями та поглинанням таких метаболітів, як коротколанцюгові жирні кислоти (SCFA), епітелій товстої кишки, тканини спланхронізму та периферичні органи. Наприклад, бутират стимулює кишковий глюконеогенез від метаболізму пропіонату та SCFA в печінці, регулює метаболізм глюкози та ліпідів та енергетичний гомеостаз 8, 9. Як повідомляється, харчові волокна та SCFA обмежують збільшення ваги через зменшення споживання їжі у гризунів 10, 11, 12 і опосередковано пов’язані із збільшенням ваги у людей 13, 14, 15 .

Харчові волокна - це різні полісахариди та олігосахариди рослинного походження. Кишкові бактерії відрізняються своєю здатністю руйнувати та використовувати харчові волокна, і, отже, різні харчові волокна суттєво змінюють склад кишкової мікрофлори 16. Метою нашого дослідження було спочатку визначити, чи сім різних харчових волокон (бета-глюкан ячменю, яблучний пектин, інулін, ефір інулінової кислоти, ефір пропіонату інуліну, ефір бутирату інуліну або комбінація ефіру пропіонату інуліну та складного ефіру інуліну) дослідження ферментації in vitro.17 були однаково захисними для запобігання ожирінню, спричиненому дієтою у мишей, і чи пов’язано це з конкретними бактеріальними профілями сліпої кишки. Оскільки одним із можливих механізмів дії клітковини є виробництво SCFA, ми також включили естулінові ефіри інуліну для оцінки ролі окремих SCFA 18, 19. Другою метою було визначити пов’язану з цим регуляцію експресії гелевих волокон у сліпій кишці, першому органі, на який впливають відмінності у сліпої бактерії та печінці, ворітному органі між кишечником та системною циркуляцією, та чи може це бути пов’язано з бактеріальними профілями.

Для цього ми використовували чітко визначену модель ожиріння, спричиненого дієтою. У минулому ми показали, що самці мишей C57B1/6J у віці 12 тижнів (24-25 грам) швидко та передбачувано набирають масу тіла, ожиріння та вміст ліпідів у печінці при годуванні HFD 20. Використовуючи цю модель для поточного дослідження, ми маніпулювали дієтичними вуглеводами, щоб замінити частку кукурудзяного крохмалю та целюлози в HFD різними ферментованими волокнами (бета-глюкан ячменю, яблучний пектин, інулін, ефір інулінової кислоти, ефір пропіонату інуліну, ефір бутирату інуліну) . або комбінація ефіру пропіонату інуліну та ефіру бутирату інуліну). Ми вимірювали споживання їжі та ожиріння одночасно з аналізом профілів після втручання бактерій, зібраних із вмісту сліпої кишки, за допомогою секвенування Illumina MiSeq та асоційованої експресії гена хазяїна в сліпій кишці та печінці.

результат

Склад тіла та споживання їжі

харчові

Відповіді лептину в плазмі, інсуліну, резистину та PYY у мишей, які отримували дієту з високим вмістом жиру (HFD), де 10% маси вуглеводів (5% кукурудзяного крохмалю, 5% целюлози) замінювали бета-глюканом (HFD + bglucan), яблучний пектин (HFD + інул P), інулін (HFD + інул), ефір інулінової кислоти (HFD + інул A), ефір пропіонату інуліну (HFD + інул P), складний ефір інуліну (HFD + інул B), пропіонат і бутират інуліну складний ефір, по 5% (HFD + інул PB) та дієта з низьким вмістом жиру (LFD). Середнє ( A ) Лептин, ( B ) Інсулін, ( C. ) Резистин (n = 5-7) та ( D ) PYY (n = 3–7). Значний (с

Повнорозмірне зображення

Бактеріальні профілі сліпої кишки були згруповані окремо на основі дієти для більшості тварин. LFD і HFD без додавання волокна були згруповані разом, що вказує на те, що наявність клітковини є основним фактором загального складу громади. Аналізи метастатів та LEfSe (величина ефекту лінійного дискримінантного аналізу) підтвердили, що існує велика кількість значущих відмінностей у таксонах компонентів між двома групами та всіма групами, що містять волокно разом (додатковий набір S4). На відміну від них, дві дієтичні групи без додавання клітковини (LFD та HFD) показали менш значущі відмінності між ними (додатковий набір S5). Ми також спостерігали, що чотири складні ефіри інуліну були розділені на дві чіткі групи: HFD + інул A/HFD + інул P та HFD + інул B/HFD + інул PB, кластеризація (Рис. 3B, додатковий набір S3). Два різні методи кластеризації (Jaccard, який містить лише наявність/відсутність OTU, та Bray Curtis, який також включає пропорційну кількість кожного OTU при порівнянні відмінностей) виявили надзвичайно значущий ефект дієти (P 1,5-кратна різниця (P 1,5 -кратна різниця (P

Валідація даних мікрочипів та відповідей на мишах, які отримували дієту з високим вмістом жиру (HFD), де 10% по масі вуглеводів (5% кукурудзяного крохмалю, 5% целюлози) було замінено на бета-глюкан (HFD + bglucan), яблучний пектин (HFD) . + пектин), інулін (HFD + інулін), ефір інулінової кислоти (HFD + інулін А), ефір пропіонату інуліну (HFD + інулін Р), складний ефір інуліну (HFD + інулін B), ефір пропіонату і бутирату, кожен 5% (HFD + PB) та дієта з низьким вмістом жиру (LFD). ( A ) RT Profiler PCR Масив вибраних генів-мішеней, які демонструють змінену регуляцію генів у відповідь на HFD + інул та HFD + PB в результаті аналізу мікрочипів сліпої кишки. Зміну складу розраховували щодо мишей, яких годували HFD, використовуючи середню ціль гена, нормалізовану до UBE2D2 (n = 6). ( B ) Експресія гена Enho в печінці мишей, яких годували HFD + DF або LFD щодо HFD. Зміна складу розраховували щодо мишей, що годували HFD, використовуючи середнє значення Enho, нормоване до UBE2D2 (n = 6). ( C. ) Рівень адропіну в печінці. T-тест Стьюдента на основі дельта-значень КТ був використаний для порівняння тестів з мишами, що годували HFD. * P ** P *** P 1, 5-кратні різниці P

Змінені онтології та шляхи, пов’язані з відомими генами, що демонструють 1,5-кратні відмінності (P

Експресія генів SAA1 і SAA2 у порівнянні з мишами, які годували дієту з високим вмістом жиру (HFD) у сліпій кишці та печінці мишей, що годували HFD, де 10% від маси вуглеводів (5% кукурудзяного крохмалю, 5% целюлози) було замінено бета-глюканом (HFD + бглюкан), яблучний пектин (HFD + інулін Р), інулін (HFD + інулін), ефір інулінової кислоти (HFD + інулін А), ефір пропіонату інуліну (HFD + інулін Р), складний ефір інуліну (HFD + інулін B ), ефір пропіонату і бутирату інуліну, по 5% (HFD + PB) та дієта з низьким вмістом жиру (LFD). Експресію гена розраховували щодо мишей, яких годували HFD, використовуючи середню ціль гена, нормалізовану до UBE2D2 (n = 5-6). Тест студента застосовували для тестового порівняння з мишами, що харчувалися HFD. * P ** P *** P 21. Целюлоза, вбудована в дієти (International Fiber Corporation), не має теплотворної здатності для господаря і замінена харчовими волокнами в дієті HFD + DF. З огляду на те, що не було помітно змін у кумулятивному споживанні їжі між СНВ та дієтою, що містить харчові волокна (рис. 1D), поряд із захистом від ожиріння, спричиненого дієтою (рис. 1А-С), наші результати свідчать про те, що чисті калорії можуть бути нижній.

SAA1 і SAA2, основні ізоформи гострої фази амілоїду А в сироватці крові, експресуються поверхневим епітелієм просвіту, вистеленим товстою кишкою 32, і, як вважають, вони забезпечують антибактеріальну роль, яка допомагає підтримувати імунний гомеостаз епітелію 32. Кодовані білки секретуються в просвіт, відіграють роль у природному розпізнаванні грамнегативних бактерій, зменшують життєздатність бактерій 32, 33 і пов'язані зі зниженим ризиком запальних захворювань кишечника 32. SAA1 та SAA2 були знижені в печінці у відповідь на HFD + DF. HFD збільшує запальну реакцію в печінці зі збільшенням циркулюючого SAA 20. Про знижену запальну реакцію в печінці свідчать нижчі рівні SAA1 та SAA2. Дослідження показали, що пошкоджений епітелій кишечника призводить до підвищення рівня циркулюючого SAA, швидше за все, з печінки 34. Таким чином, протилежний вплив клітковини на SAA1 та SAA2 у сліпій кишці та печінці може бути пов’язаний (рис. 5E).

Харчові волокна, що регулюють регулювання Tex19. 1, який має обмежену експресію в плюрипотентних стовбурових клітинах 35 та інгібує ретротранспозони 36. Техас19. 1 потенційно стабілізує геном стовбурових клітин кишечника під час реплікації та регенерації епітелію кишечника, пов'язуючи прийом клітковини з протираковими ефектами.

методи

Тварини та дієтичне втручання

Бактеріальний аналіз слізої кишки

Геномну ДНК (гДНК) екстрагували із вмісту сліпої кишки за допомогою набору FastDNA® SPIN Kit для ґрунту (MP Biomedicals, Illkirch, Франція). Загальну чисельність бактерій в сліпої кишці оцінювали після дієтичних втручань за допомогою кількісної ПЛР, а область V3-V4 бактеріальних генів 16S рРНК секвенували на Illumina MiSeq з використанням проточної клітини v3 з парним кінцевим зчитуванням 2 × 300 п.н. кроки, доступні у Додатковому файлі S2). Дані секвенування, сформовані під час цього дослідження, доступні в базі даних SRA в рамках приєднання до SRA SRP117745 (доступно за адресою //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP117745).

Гормони плазми

Гормони вимірювали в плазмі крові із серцевої пункції (CP) або з ворітної печінкової вени (HPV) (n = 4–8), зібраних із включенням коктейлю інгібітора протеази загального застосування (Sigma cat # P2714), використовуючи металевий гормональний метаболічний гормон Millipore MILLIPLEX MAP Mouse Бісерна панель (Merck Millipore, Feltham, Великобританія).

Жир печінки

Загальний жир витягували з лівих часток печінки за методом Folch et al. 43 і розраховано вагу жиру на мікрограм тканини печінки.

Аналіз мікрочипів цілого геному

Загальну РНК, вилучену з печінки та сліпої кишки за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen, Кролі, Великобританія), мікродисперсували за допомогою миші SurePrint G3 GE 8 × 60 K Microarray G4852A (Agilent Technologies, UK) (Додатковий файл S2). Дані депонуються в NCBI Gene Expression Omnibus 44 і доступні через номер доступу GEO Series GSE106375 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE106375). Деталі статистичного аналізу даних мікрочипів наведені у додатковому файлі S2.

Підтвердження мікрочипів виявило відмінності у експресії генів за допомогою спеціально розроблених ПЛР-масивів RT Profiler

Гени, що демонструють змінені відповіді на HFD + інулін або HFD + інул PB-ефіри в сліпій кишці, були ідентифіковані за допомогою аналізу мікрочипів та перевірені за допомогою спеціально розробленого RT Profiler PCR Array (Qiagen) (Додатковий файл S2).

ПЛР у режимі реального часу

Додаткові шаблони кДНК для аналізів ПЛР у режимі реального часу були підготовлені з Суперскрипту II (Invitrogen) із зворотною транскрипцією загальної РНК, а аналізи Taqman проводились з дуплексною мішенню та еталонним геном UBE2D2. (Додатковий файл S2).

Адропін печінки (Enho)

Для вимірювання адропіну застосовували набір імуноферментного аналізу (ELISA) (Cusabio USA) відповідно до інструкцій виробника. (Додатковий файл S2).

Статистичний аналіз

Подробиці статистичного аналізу послідовності мікробіоти сліпої кишки, даних сліпої кишки та печінки можна знайти в Додатковому файлі S2. Інші дані представлені як середнє значення ± SEM і проаналізовані за допомогою GenStat (Gen Stat®13th Edition (VSN International, Ltd., Hemel Hempstead, UK), крім даних RT-PCR, які були проаналізовані за логарифмічною шкалою (дельта-КТ), але представлені як складчасті зміни (відмінності, що не реєструються) без стандартних помилок. Порівняння дієтичної групи з групою з високим вмістом жиру проводили за допомогою t-тестів. Вплив одного фактора та порівняння між дієтичними групами перевіряли за допомогою одностороннього ANOVA Багаторазові порівняння тестували, використовуючи захищений або незахищений тест ЛСД Фішера. Перекошені дані були перетворені в журнал перед статистичним аналізом.

Дякую

Ця робота була підтримана Шотландським урядом з питань науки та аналітичних послуг у галузі сільських та екологічних питань Стратегічного партнерства. Ми також визнаємо підтримку обчислювального кластера Максвелла, що фінансується Абердинським університетом. Ми вдячні Гілу Кемпбеллу за проведення аналізу мікрочипів, Донні Хендерсон за аналіз жиру печінки (Інститут Роветта, Університет Абердіна) та Піту Хедлі (Інститут Джеймса Хаттона, Данді), за сканування масивів Agilent.

Електронний додатковий матеріал

Додаткова інформація

Додатковий набір даних

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.