- Предмети
- Резюме
- Вступ
- Результати і обговорення
- Мікробіота кишечника та H. pylori впливали на рівень лептину та греліну
- Індуковане нормальне вироблення інсуліну для мікробіота кишечника та H. pylori
- PYY, індукований H. pylori але пригнічується нормальною мікробіотою кишечника
- Кишкові метаболічні гормони та маса тіла
- Можливий вплив на мікробіоти кишечника та H. pylori на початку розвитку
- Методи
- Штам H. pylori та підготовка посівного матеріалу
- Тварини та щеплення
- Етичні заяви
- Збір зразків плазми
- Мультиплексний аналіз на кишкові гормони та цитокіни
- статистичний аналіз
- Коментарі
Предмети
- Клінічна мікробіологія
- Експериментальні моделі захворювань.
Резюме
Вступ
Давній шлунковий збудник, Helicobacter pylori, є ключовим членом мікробіому шлунку людини. Він розвинувся разом із людською расою, і наша асоціація з H. pylori налічує 60 000 років 9. Крім того, воно мешкає в шлунку більше половини світового населення, незалежно від їх етнічного походження та географічного регіону 10. Багато людей придбали бактерії в ранньому дитинстві шляхом внутрішньосімейного передавання та колонізації протягом усього життя, якщо не викорінити за допомогою медичного втручання 9. Хоча більшість носіїв залишаються безсимптомними, приблизно у 20% з них з часом розвиваються гастродуоденальні захворювання (такі як хронічний гастрит, виразкова хвороба шлунка та аденокарцинома шлунка) на останніх стадіях життя. Багато факторів, включаючи H. pylori, мікробіоту кишечника, господаря та навколишнє середовище, можуть сприяти розвитку хвороб, асоційованих з H. pylori. .
У цьому дослідженні наша мета полягала у дослідженні взаємодії між H. pylori та нормальною мікробіотою кишечника на ранніх стадіях життя за допомогою моделей мишей GF та SPF. Для того, щоб зрозуміти вплив H. pylori та нормальної мікробіоти кишечника на розвиток метаболічної та імунної систем, ми оцінили зміни метаболічних гормонів кишечника та цитокінів/хемокінів у відповідь на колонізацію H. pylori у мишей. GFH та SPFH.
Результати і обговорення
Ми вилучили H. pylori у мишей, інокульованих SPFH та GFH, через 2, 8 та 16 тижнів після колонізації. Це продемонструвало, що штам 298 H. pylori успішно колонізував шлунок мишей, щеплених цим організмом. З іншого боку, жодна з мишей SPF та GF не була позитивною на H. pylori .
Вплив H. pylori на склад та функцію нормального мікробіома кишечника до кінця не з’ясовано. Однак у цьому дослідженні наші попередні результати продемонстрували, що H. pylori може змінити енергетичний гомеостаз свого господаря, і що нормальний мікробіом кишечника може вплинути на вплив H. pylori на свого господаря.
Кишкові метаболічні гормони та маса тіла
Мета-аналіз, що повідомляє про рівень поширеності H. pylori та ожиріння у випадкових зразках популяції понад 100 осіб, виявив зворотну кореляцію між поширеністю бактерій та рівнем надмірної ваги/ожиріння у розвинених країнах 29. Раніше було показано, що рівні циркулюючого з їжею лептину та греліну змінюються після ерадикації H. pylori у добровольців-людей із пов’язаним збільшенням індексу маси тіла (ІМТ), що свідчить про те, що колонізація H pylori може регулювати рівень греліну та лептину, впливає на морфометрію тіла 30. У цьому дослідженні було показано, що колонізація H. pylori у молодих мишей GF призводить до зменшення приросту маси тіла.
Миші SPFH мали значно вищий лептин, інсулін та PYY натще, ніж миші SPF. Незважаючи на різницю в рівні гормонів, миші SPFH мали нормальну масу тіла. Ми постулюємо, що пов'язана з H. pylori регуляція PYY стимулювала господаря виробляти більше інсуліну та лептину у відповідь, підтримуючи таким чином нормальну масу тіла. Однак довгострокові наслідки збільшення PYY голодування, інсуліну та лептину ще не визначені. З іншого боку, миші GF та GFH мали більшу кількість греліну, нижчий лептин та нижчий інсулін, ніж миші SPF та SPFH. Крім того, миші GFH у віці 16 тижнів мали більш високий рівень PYY, ніж миші GF. Всі ці гормональні відмінності між мишами GF та GFH порівняно з мишами SPF та SPFH можуть бути пов'язані з масою їх тіла. Цікаво, що вплив H. pylori на масу тіла був більш очевидним у мишей GFH за відсутності нормальної мікробіоти кишечника.
Визначено взаємозв'язок між масою тіла та різними метаболічними гормонами кишечника/еотаксином-1 (табл. 1). Було показано, що рівні лептину та PYY суттєво пов’язані між собою (стор. 30. Тому метаболічні гормони, які регулюють H. pylori, можуть відігравати певну роль у утриманні ожиріння.
Можливий вплив мікробіоти кишечника та H. pylori на ранній розвиток
Хайц і співавт. повідомляли, що ті самі миші GF, що використовувались у цьому дослідженні, демонстрували більшу рухову активність та менше тривоги порівняно з мишами SPF 8. Це корелювало зі зміненою експресією генів, які регулюють моторний контроль та поведінку, подібну до тривоги. Той самий звіт також показав, що миші GF, які піддавалися дії нормальної мікробіоти кишечника на ранніх стадіях життя, мали схожі характеристики з мишами SPF. Це спостереження може бути пов'язане зі зміною поглинання поживної речовини у мишей GF за відсутності нормальної мікробіоти кишечника, що призводить до недоїдання та втрати ваги. Загальновідомо, що рівень харчування безпосередньо впливає на ранні стадії розвитку (включаючи розвиток мозку та наставника). Крім того, було показано, що нокаутовані миші греліну підвищують тривожність у відповідь на різноманітні стресові фактори, такі як гострий стрес-обмеження та соціальний стрес, в експериментальних умовах 31. Більш високий рівень греліну у мишей GF може також пояснити змінену поведінку мишей GF, про яку повідомляють Heijtz et al. .
Підвищений рівень еотаксину-1 у плазмі крові також пов'язаний зі старінням у мишей та людей 32. Виявлено, що вплив молодих мишей на еотаксин-1 або плазму крові від старших мишей знижує їх нейрогенез та когнітивні показники у поведінкових завданнях, які залежать від нейрогенезу в гіпокампі 32. Цікаво, що велике ретроспективне когортне дослідження в Данії встановило кореляцію між хронічним H. pylori та/або гастритом та хворобою Паркінсона 33. Встановлено, що рівень хемокінів, еотаксин-1, був вищим у мишей SPFH (стор. 34. Отже, високий рівень еотаксину-1 у мишей SPFH змусив нас припустити, що ці хемокіни слугували ознакою. Раннє запалення та взаємодія між H. pylori та нормальна мікробіота кишечника можуть посилити хронічне запалення. Тому вплив H. pylori на ранніх стадіях розвитку може мати довгострокові наслідки для розвитку мозку. На жаль, ми не проводили жодних поведінкових досліджень або тести моторного контролю в цьому дослідженні для підтвердження цього.
На закінчення, це дослідження на мишах SPF та GF з H. pylori та без нього передбачає, що шлунковий збудник, H. pylori, взаємодіє з нормальною мікробіотою кишечника, змінюючи метаболічні та запальні шляхи у мишей SPFH порівняно з мишами SPF (Рисунок 3). Наші результати також свідчать про те, що між H. pylori та нормальною мікробіотою кишечника існує постійний перехресний зв’язок, який пов’язаний із запаленням кишечника. Попередні дані встановили причинний зв'язок між H. pylori та виразкою шлунка та раком шлунка. Дані, представлені в цьому дослідженні, що пов’язують H. pylori з перехресними зв’язками з нормальною мікробіотою кишечника, свідчать про те, що початок захворювання, опосередкованого H. pylori, у людини є більш складним. Тому додаткові експерименти високо гарантовані, особливо в перші роки життя.
Нормальна мікробіота кишечника відіграє важливу роль у регуляції гомеостазу метаболічного гормону в кишечнику, що впливає на розвиток нормальної маси мозку та тіла. Крім того, нормальна мікробіота кишечника також впливає на результат колонізації H. pylori, впливаючи на метаболічні гормональні зміни в кишечнику та індуковане запалення H. pylori. .
Повнорозмірне зображення
Методи
Препарат H. pylori та препарат посіву
У цьому дослідженні використовували штам H. pylori, адаптований до мишей C57BL/6, 298. Геном цього штаму був повністю секвенсований 35. Коротко, H. pylori культивували в інфузійному відварі серця мозку, доповненому 0,4% екстрактом дріжджів та 1% ß-циклодекстраном (BHYC), протягом 4 днів при 37 ° C у зволоженому інкубаторі з вмістом СО2 10%. Кількість бактерій було відрегульовано до концентрації 10 9 бактерій на мл, що було використано для щеплення тварин.
Тварини та щеплення
Для експериментів використовували самців SPF та GF C57BL/6 мишей віком від 4 до 6 тижнів. Використовували мишей-самців, оскільки, як повідомляється, вони виявляють більшу частоту розвитку шлункової карциноми кишкового типу, ніж жінки 36. Усі миші (SPF та GF) утримувались у стерильних пластикових ізоляторах у Центрі вільного від зародків (NCC) Національного онкологічного центру, що знаходиться в Центрі експериментальної медицини SingHealth. Тварин утримували в автоклаві R36 Lactamin Chow (Лактамін, Швеція) та витримували в умовах світлового циклу 12 год. Тварин розділили на чотири групи по 12 осіб (SPF, SPFH, GF та GFH). Мишей SPF та GF для інокуляції H. pylori голодували протягом ночі та годували внутрішньошлунково 0,1 мл бактеріальної культури тричі з інтервалом 1 день у середовищі. Контрольним тваринам інокулювали стерильні BHYC-середовища таким же чином. Згодом мишей забивали через 2 тижні (N = 3 на групу), 8 тижнів (N = 5) та 16 тижнів (N = 5) після колонізації. Миші збирали для культури H. pylori, а плазму використовували для аналізу гормонів та цитокінів.
Етичні заяви
Усі експериментальні процедури були затверджені та проведені відповідно до норм та керівних принципів інституційного комітету з догляду та використання тварин SingHealth (IACUC; заявка № 2011/SHS/680) та Національного комітету з питань раку Національного центру раку Сінгапур/SingHealth Biosafety Committee (СПК); Заявка № 010/РБК/2011).
Збір зразків плазми
Кров відбирали в охолоджені пробірки, покриті ЕДТА, і обережно перемішували шляхом інверсії. Кров переносили в холодну пробірку Еппендорфа, що містить 2М 4- (2-аміноетил) бензолсульфонілфториду гідрохлориду (AEBSF, Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцарія), до кінцевої концентрації 0,2М і обережно перемішували. Пробірку центрифугували при 3000 × g протягом 3 хв (4 ° C). Отриману плазму додавали до кріотрубки, що містить 1 N HCl, щоб отримати кінцеву концентрацію 0,1 N і зберігали при -80 ° C до аналізу.
Культуру H. pylori зі шлунку миші гомогенізували та засівали на пластинки з шоколадним агаром, доповнені 7% лізованою конем крові, а у випадку селективних середовищ - триметопримом (5 мкг/мл), ванкоміцином (10 мкг/мл), налідіксової кислоти. (20 мкг/мл) та амфотерицин В (5 мкг/мл) були додані. Усі антибіотики були від корпорації Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Агарові пластини інкубували одночасно при 37 ° С у зволожених умовах з 10% вуглекислого газу. Колонії, подібні до H. pylori, були підтверджені позитивністю за допомогою тестів на уреазу, оксидазу та каталазу.
Мультиплексний аналіз на кишкові гормони та цитокіни
Набір Milliplex MAP для мишачої металевої магнітної бісерної панелі (Каталог # MMHMAG-44K; Millipore Corp., MO, USA) був використаний для кількісної оцінки восьми гормонів кишечника, які є важливими регуляторами споживання їжі., Витрати енергії та маси тіла: ацильований (активний ) грелін, лептин, активний амілін, інсулін, активний глюкагоноподібний пептид-1 (GLP-1), загальний шлунковий інгібуючий поліпептид (GIP), загальний пептид YY (PYY) та поліпептид підшлункової залози (PP). Панель мишачих магнітних гранул цитокінів/хемокінів (каталог # MPXMCYTO-70K; Millipore Corp., MO, США) була використана для вимірювання панелі з 32 різних мишачих цитокінів/хемокінів. Використовували плазму, а випробування проводили відповідно до інструкцій виробника. Вимірювання проводили на системі Luminex 200 ™ із програмним забезпеченням xPONENT ™, версія 3.1 (Luminex, Остін, Техас, США).
статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення IBM SPSS версії 22.0. Односторонній ANOVA (альфа = 0,05) та чесно значуща різниця Тьюкі (HSD) після спеціального тесту. Виконано параметричну кореляцію Пірсона. Значення р