корисним

  • Резюме
  • Довіритель
  • Матеріали і методи
  • Зразки тканин
  • Тканинні матриці
  • Вестерн-блот-аналіз
  • Імуногістохімічне фарбування
  • Результати
  • Обговорення

Резюме

Довіритель

Рак невідомого первинного місця є сьомим та восьмим найбільш поширеним раком, виявленим у клінічній практиці. 1 Річна захворюваність на 100 000 населення з урахуванням віку становить від 7 до 12 випадків у Сполучених Штатах, 18 в Австралії та 6 у Нідерландах. Це четверта найпоширеніша причина смерті від раку як у чоловіків, так і у жінок. 2 Оскільки оптимальне лікування раку пов’язане з місцем первинної пухлини, відсутність ідентифікації первинного місця викликає значні проблеми під час лікування пацієнтів. На аденокарциноми припадає майже половина всіх невідомих первинних ракових пухлин. Використання імуногістохімії для виявлення специфічних антигенів на пухлинних клітинах призвело до значного поліпшення діагностики ракових захворювань. Наприклад, специфічний для простати антиген використовується як маркер раку простати. 3 Фактор транскрипції щитовидної залози є маркером раку легенів. 4 Однак хорошого маркера для пухлин шлунково-кишкового тракту (ШКТ) все ще бракує.

Кадхерин-17, який також називають печінково-кишковим кадгерином або пептидним транспортером-1 людини, є членом надсімейства кадгеринів і є молекулою адгезії клітинних клітин, що залежить від Са2 +. 5, 6 На відміну від так званих класичних кадгеринів, таких як E, N та P кадгерини, кадгерин-17 має сім повторень кадгерину замість п’яти у позаклітинному домені та лише 20 амінокислотних залишків у цитоплазматичному домені. Помітно короткий цитоплазматичний домен позбавлений гомології з іншими кадгеринами, і адгезивна функція кадгерину-17 не залежить від асоціації з іншими білками цитоплазми. 7 Підклітинний розподіл кадгерину-17 також відрізняється від класичних кадгеринів. У епітеліальних клітинах кишечника Е-кадгерин концентрується в прилеплених місцях з'єднання, тоді як кадгерин-17 рівномірно розподіляється вздовж бічної зони контакту. 8

Розподіл кадгерину-17 в тканинах відрізняється за видами. У щурів кадгерин-17 експресується в печінці та клітинах епітелію кишечника. У людей та мишей експресія обмежена клітинами епітелію кишечника і не виявляється в печінці. 9 Обмежений розподіл 17-кадгерину в нормальних тканинах свідчить про те, що він може бути корисним маркером для виявлення первинних ділянок пухлини. Як повідомляється, кадгерин-17 експресується в колоректальному, шлунковому, 11, 12 та раку підшлункової залози. 13 Невідомо, чи виражається воно в пухлинах в інших органах.

Отже, в цьому дослідженні ми вивчали експресію кадгерину-17 в пухлинах, отриманих з різних ділянок тіла, використовуючи тканинні матриці. Ми виявили, що кадгерин-17 дифузно і сильно експресується в колоректальних аденокарциномах, розсіяно експресується в аденокарциномах шлунка, підшлункової залози та жовчної протоки і практично не експресується в пухлинах в інших місцях тіла. Наше дослідження вказує, що кадгерин-17 може бути корисним маркером для ідентифікації первинних місць метастатичних аденокарцином.

Матеріали і методи

Зразки тканин

Фіксовані формаліном, вкладені в парафін тканинні блоки були отримані з 518 раніше охарактеризованих первинних карцином та 60 непухлинних тканин з архівів Департаменту патології Національної лікарні Тайванського університету. Дослідження проводилось згідно з рекомендаціями нашої інституційної комісії з огляду. Ці випадки пухлин включали 44 раки молочної залози, 39 карцином шийки матки, 33 холангіокарциноми, 47 колоректальних раків, 57 гепатоцелюлярних карцином, 50 раків легенів, 47 ниркових клітин, 89 раків яєчників, 28 раків підшлункової залози, 39 раків простати та 45 шлунка. рак Спектр дослідженої непухлинної тканини наведено в таблиці 1.

Повний розмір таблиці

Тканинні матриці

Цільові ділянки тканин позначали на зрізах, пофарбованих Н та Е. Для кожного випадку було видалено серцевину тканини розміром 2 мм за допомогою ручного матричного пристрою тканин (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, США) та вставляли у парафіновий блок рецепторів. Об’єднані тканини розрізали на зрізи товщиною 4 мкм і розмістили на позитивно заряджених предметних стеклах.

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот проводили на білкових лізатах з 11 репрезентативних нормальних та пухлинних тканин, включаючи нирки, печінку, товсту кишку, тонку кишку, шлунок, селезінку, щитовидку, підшлункову залозу, плаценту, а також карциноми яєчників та легенів. Подібні кількості загального білка з кожного лізату відокремлювали, використовуючи полікрикриламідні гелі Tris-glycine-SDS-8% (Novex, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), а потім переносили в мембрани полівінілідендифториду Impobilon-P за допомогою Millipore. Мембрани досліджували мишачим моноклональним анти-кадгерин-17 антитілом, клоном 1H3 (IgG1), у концентрації 1 мкг/мл (Abnova, Тайбей, Тайвань) з подальшим кон'югованим з пероксидазою козячим антимишачим імуноглобуліном (1: 2500 ). Вестерн-блот були розроблені з використанням хемілюмінесценції (Пірс, Рокфорд, Іллінойс, США).

Імуногістохімічне фарбування

Зрізи тканин депарафінізували та регідратували. Відновлення антигену проводили інкубацією предметних стекол в 0,01 М буфері лимонної кислоти (pH 6,0) при 100 ° C протягом 10 хв. Після блокування 3% H2O2 та 5% фетальної бичачої сироватки предметні стекла реагували з моноклональним антитілом проти кадгерину-17 (клон 1H3, Abnova), цитокератину 7 (DakoCytomation, Glostrup, Данія), цитокератину 20 (DakoCytomation) або CDX -2 (Biogenix, Сан-Рамон, Каліфорнія, США) при розведенні 1: 100 при 4 ° C протягом ночі. Слайди інкубували з реагентом полімер-HRP (BioGenex). Активність пероксидази візуалізували за допомогою розчину діамінобензидину тетрагідроксихлориду (BioGenex). Зрізи фарбували гематоксиліном. Темно-коричневе перетинчасте фарбування було визначено як позитивне, а жодне фарбування не було визначено як негативне. Для негативного контролю ми замінили первинне антитіло 5% фетальною бичачою сироваткою. Фарбування оцінювали наступним чином: 0 (фарбування не виявляється); 1+ (75%). У клітинах із позитивним фарбуванням фарбування було інтенсивним і рівномірним, тому інтенсивність не враховувалась у балах.

Результати

Ми вперше визначили специфічність анти-кадгерин-17 антитіла (клон 1H3) за допомогою вестерн-блот-аналізу. Експресія кадгерину-17 була виявлена ​​виключно в людських лізатах тонкої кишки та товстої кишки, а не в лізатах інших нормальних тканин та пухлин (рис. 1). Антитіло було специфічним для білка кадгерин-17, оскільки в лізатах тонкої кишки та товстої кишки була присутня одна смужка з видимою молекулярною масою приблизно 110 кДа. Ця смуга відповідала білку кадгерин-17. Як виявилося за допомогою Вестерн-блот-аналізу, не було виявлено перехресної реакції з іншими білками.

Вестерн-блот-аналіз білка кадгерин-17 у тканинних лізатах. У кожну смугу завантажували однакову кількість білка (25 мкг). Серед цих пухлин лише тканини товстої кишки та тонкої кишки експресували білок кадгерин-17. Кадхерин-17 розглядається як одиночна смуга з молекулярною масою 110 кДа.

Повнорозмірне зображення

У таблиці 1 показано розподіл кадгерину-17 в нормальних тканинах за допомогою імуногістохімії у зразках тканинних матриць. Сильне дифузне перетинчасте перефарбування кадгерину-17 спостерігалося в епітелії кишечника, включаючи зразки, взяті з тонкої кишки, апендикса та слизової оболонки прямої кишки (рис. 2а та б). Кадерін-17 експресувався в поверхневому епітелії дванадцятипалої кишки, але не в залозі Бруннера. Кадгерин-17 не експресувався в нормальній слизовій оболонці шлунка (рис. 2в), але спостерігався в районах з метаплазією кишечника. Жоден інший тип тканини не мав виявленої експресії кадгерину-17 (малюнки 2d-f).

Імуногістохімічне фарбування кадгерину-17 в нормальній тканині. Кадгерин-17 експресувався в епітеліальних клітинах товстої кишки ( до ) і тонкої кишки ( b ), але не в слизовій оболонці шлунка ( c ), печінку ( d ), легені ( і ) або простати ( F ).

Повнорозмірне зображення

У таблиці 2 наведені результати імуногістохімічного фарбування 17-кадгерину 518 пухлин з різних ділянок тіла. Мембранне фарбування кадгерином-17 було у 45 (96%) із 47 раків прямої кишки; 38 (81%) із 47 показали дифузне фарбування (> 75%) (рис. 3а). Кадерін-17 також виражався у 25 (56%) з 45 аденокарцином шлунка, 16 (57%) з 28 аденокарцином підшлункової залози та 9 (27%) з 33 холангіокарцином (малюнки 3b-d). Більшість аденокарцином шлунка, підшлункової залози та жовчних шляхів (42 із 50, 84%) мали фокальний або розсіяний характер фарбування. Кадгерин-17 рідко експресувався в пухлинах з інших ділянок тіла (малюнки 3e та f). З 331 обстеженої пухлини кадгерин-17 експресувався лише в 1 (0,3%) аденокарциномі передміхурової залози.

Повний розмір таблиці

Імуногістохімічне фарбування кадгерину-17 в тканині пухлини. Кадгерин 17 експресувався в колоректальній аденокарциномі ( до ), Аденокарцинома шлунка ( b ), аденокарцинома протоки підшлункової залози ( c ) та холангіокарцинома ( d ), але не при аденокарциномі легенів ( і ) або простати ( F ).

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

Експресія кадгерину-17 та цитокератину 7 у колоректальній, шлунковій та підшлунковій аденокарциномі. ( до, b ) Кадерин-17 позитивна колоректальна аденокарцинома ( до ) і негативний для цитокератину 7 ( b ). ( c, d ) Позитивна адекаркарнома шлунку кадгерин-17 ( c ) та цитокератин 7 ( d ). ( і, F ) Позитивна аденокарцинома підшлункової залози на кадгерин-17 ( і ) та цитокератин 7 ( F ).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Аденокарцинома невідомої первинної ділянки є однією з найпоширеніших клінічних проблем. Сім найпоширеніших основних ділянок - це молочна залоза, товста кишка, легені, яєчники, підшлункова залоза, простата та шлунок. 15 Оскільки метастатичні аденокарциноми з різних місць можуть мати подібний мікроскопічний вигляд, ідентифікація первинного місця є складною. Було виявлено декілька імуногістохімічних маркерів для допомоги в гістологічній діагностиці, включаючи цитокератин 7, цитокератин 20, фактор транскрипції щитовидної залози 1, CDX2, специфічний для простати антиген та мезотелін. 3, 4, 15 Однак високоспецифічний маркер для аденокарциноми шлунково-кишкового тракту все ще відсутній.

Кадгерин-17 - це адгезійний білок, який зазвичай експресується лише в епітелії кишечника. Ця дуже специфічна локалізація робить 17-кадгерин потенційним інструментом для імуногістохімічної діагностики. Наші результати показують, що експресія кадгерину-17 дуже поширена при аденокарциномах прямої кишки, а також у більш ніж половині аденокарцином шлунка та підшлункової залози, а також у невеликій кількості холангіокарцином. Його вираження не обмежується пухлинами з метаплазією кишечника. Крім того, експресія кадгерину-17 дуже рідка при карциномах поза шлунково-кишкового тракту. Ці спостереження роблять 17-кадгерин корисним маркером для гістологічної діагностики аденокарциноми невідомої первинної ділянки.

Для подальшої диференціації колоректальних пухлин від пухлин, що походять із верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, використовували два підходи. Експресія кадгерину-17 у колоректальній аденокарциномі, як правило, була дифузною та сильною, тоді як експресія в аденокарциномах верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, як правило, була вогнищевою або розсіяною. Іншим підходом, який ми використовували, було імунофарбування цитокератину 7. Імунореактивність цитокератину 7 спостерігалася в аденокарциномах більшості ділянок тіла, обмежуючи його клінічне застосування. Однак використання кадгерину-17/цитокератину 7 з двома маркерними профілями значно зменшило кандидат первинного сайту. У нашому наборі даних 37 з 38 (97,3%) кадгерин-17 (+)/цитокератин 7 (-) пухлин були колоректальними аденокарциномами. Іншою була аденокарцинома шлунка. З 56, 49 (86,0%) кадгерин-17 (+)/цитокератин 7 (+) пухлин були аденокарциномами шлунка, підшлункової залози або жовчних шляхів, 6 - аденокарциномами прямої кишки та 1 - аденокарциномою передміхурової залози. Отже, профіль кадгерин-17/цитокератин 7 може диференціювати аденокарциному верхнього та нижнього відділів шлунково-кишкового тракту з високою специфічністю.

У нашому наборі тканин кадгерин-17 експресується у понад 95% колоректальних аденокарцином. Один із двох імунонегативних випадків прийому кадгерину-17 відповідав критеріям мінімально диференційованих карцином товстої кишки великих клітин, 16 пухлини, що характеризується втратою залозистої диференціації та мікросателітною нестабільністю. Іншою була аденосквамозна карцинома. Кадерін-17 експресувався лише у трохи більше половини аденокарцином шлунка та підшлункової залози та у 27% холангіокарцином. Ці результати вказують на те, що аденокарцинома кадгерину-17 (-) навряд чи може бути колоректальною аденокарциномою, проте не можна повністю виключати можливість того, що вона виникає із шлунку, підшлункової залози та жовчовивідних шляхів.

Зразки тканин, що використовуються в наборі тканин, були отримані з первинних ділянок пухлини. Залишається уточнити, чи зберігав 17-кадгерин свою корисність при метастатичних пухлинах. При раку шлунка експресія кадгерину-17 була значно частішою у випадках запущеної стадії 11, але при раку підшлункової залози та прямої кишки кадгерин-17 частіше спостерігалася у добре диференційованих пухлинах 10, 13 без лімфатичних метастазів у лімфатичні вузли. Подальше тестування на зразках біопсії від додаткових метастатичних ракових захворювань було б доцільним.