Резюме

Ліва пневмонектомія гризунів є цінною методикою дослідження легеневої гіпертензії. Тут ми представляємо протокол, який описує процедуру пневмонектомії щурів та післяопераційну допомогу щодо мінімальної захворюваності та смертності.

пневмонектомія

Анотація

Вступ

Легенева артеріальна гіпертензія (ЛАГ) - прогресуюче та летальне захворювання, що характеризується посиленням легеневого кровотоку, збільшенням судинного опору, запаленням та реконструкцією дрібних легеневих судин. Це ремоделювання, як правило, призводить до судинних уражень, які перешкоджають і стирають дрібні легеневі артерії, викликаючи звуження судин і збільшене додаткове навантаження правого шлуночка 2. Є кілька успішних медикаментозних методів лікування ПАГ; як наслідок, ПАУ залишається високою смертністю. Останнім часом фокус досліджень у патобіології легеневої гіпертензії перемістився до механізму, за якого роль посиленого легеневого кровотоку вважається важливим пусковим фактором у розвитку ремоделювання ангіопроліферації судин легенів 3, 4 .

Новизна цього рукопису представлена ​​в дуже докладному та повному хірургічному протоколі лівої пневмонектомії у щурів та в обговоренні технічних та фізіологічних проблем цих моделей. Оскільки цей протокол наразі недоступний, багато дослідників вважають, що модель надто складна. Дослідники, які провели ліву пневмонектомію, стикаються з високими показниками смертності та захворюваності, пов’язаними з непотрібною втратою тварин, що загрожує науковій оцінці. Натомість багато хто використовує класичні моделі, такі як ін’єкція МСТ, хронічна гіпоксія або пневмонектомія для створення ПАУ. Однак ці моделі набагато менш ефективні, ніж комбінація МСТ або Сугена з лівою пневмонектомією. Основна мета цієї статті - надати перший детальний та відтворюваний хірургічний протокол односторонньої лівої пневмонектомії у щурів та надати найкращу хірургічну модель БАГ. Поєднання цього протоколу лівої односторонньої пневмонектомії з MCT або SU5416 дозволить дослідникам створити набагато більш ефективну та клінічно значущу модель важкої ПАГ для вивчення патогенезу цієї летальної хвороби.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Викладені нижче процедури були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Медичної школи Ікана на горі Синай. Усі щури, яким надавали гуманний догляд, відповідають Горі Синай "Керівництво з догляду та використання лабораторних тварин".

1. підготовка до операції

  1. Автоклавні вигнуті ножиці Cooley-Mayo (великі ножиці), прямі ножиці Iris (маленькі ножиці), ножиці Iris Vannas McPherson (задні ножиці), щипці тканини Wangensteen (атравматичні щипці), щипці тканини Gerald, звичайний дротяний дзеркало (самозберігаючий ретрактор), припікач для невеликих судин, марлеві прокладки, подвійний зонд, тонкодержатель судинної голки та гемостатичні щипці від комарів Jacobson Micro (комар).

2. підготовка та інтубація щурів

3. стерильне приготування середовища

  1. Візуалізуйте хірургічну область під мікроскопом. Це потрібно зробити спочатку, оскільки мікроскоп не можна регулювати, коли середовище стерильне.
  2. Одягніть стерильні хірургічні рукавички. Не торкайтесь нічого, крім стерильних інструментів, хірургічних портьєр та хірургічної ділянки тіла щура!.
  3. Покладіть стерильну завісу на тіло щура та на піддон для інструментів, щоб створити стерильне середовище.
  4. Одягнувши стерильні рукавички, покладіть стерильні інструменти на стерильний піддон.

4. Ліва хірургічна процедура Пневмонектомія

5. післяопераційне відновлення

  1. Помістіть тварину в стернальне положення. Вимкніть ізофлуран, але продовжуйте подавати щуру кисень через ендотрахеальну трубку. Не залишайте тварину без нагляду в будь-який час, поки ви не прийдете в свідомість, щоб ходити, і тварина в клітці.
  2. Введіть підшкірно 2-3 мл стерильного розігрітого розчину Рінгера.
  3. Контролюйте частоту серцевих скорочень (≈200 - 500 уд/хв), насиченість киснем (≥95%) та колір тварини, щоб підтвердити, що тварина добре дихає.
  4. Коли тварина починає робити спонтанні дихальні рухи та рухи шиєю і реагує на фізичні подразники (наприклад, розширення очей, рух носа та вух у відповідь на звук), екстубуйте тварину, витягнувши трубку, та відключіть вентилятор.
  5. Поверніть тварин у порожню клітку, в компанії інших тварин. Тварина повинна бути одна не менше 3 днів.
  6. Для контролю болю вводьте бупренорфін 0,1 мг/кг підшкірно кожні 12 годин протягом 3 днів.

6. MCT або адміністрація Сугена "Друге потрапляння"

  1. Вводьте підшкірно 1 мл MCT (60 мг/кг) або 1 мл Sugen (25 мг/кг) через тиждень після операції.

7. термінал збору врожаю

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Згідно із загальноприйнятою системою класифікації, легенева гіпертензія характеризується середнім тиском у легеневій артерії (MAPP), що перевищує верхню межу нормального тиску в легеневій артерії (тобто 25 мм рт. Ст.). У групі пневмонектомія + MCT до 21-го дня розвинулася важка ЛАГ із вищим РАР (рис. 1). MPAP розраховується за формулою:

Систолічний та діастолічний тиск, RV та PA і вимірювались за допомогою катетера тиску в головній легеневій артерії, підключеному до фотоелектричної установки. Середній легеневий артеріальний тиск (PAPM) розраховували за наведеною вище формулою. У контрольній групі (n = 20) середній тиск АТ становив 18,6 ± 1,76 мм рт.ст. (рис.1). У групі пневмонектомія + МСТ (n = 30) РАР збільшився у 2,25 рази більше порівняно з контрольною групою (41,9 ± 2,89 мм рт. Ст.) (Рис. 1). У групі пневмонектомії Суген + (n = 30) РАР було втричі вище, ніж у контрольній групі (53 ± 6,60 мм рт. Ст.). У групах MCT та Sugen RVSP був набагато вищим у порівнянні з контрольною групою (рис.1).

Гістопатологію легеневої тканини щурів проводили за допомогою гематоксиліну та еозину з подальшою візуалізацією за допомогою оптичного світлового мікроскопа. У нормальній легені між альвеолами є простір, і альвеолярні структури очевидні. Посудини прозорі та нормальної товщини (рис. 2А). У легенях ПАУ є дані про перебудову, потовщення стінок судин, сильне звуження судин та вогнищевий легеневий артеріїт (Рисунок 2B, C.).


Малюнок 1: важка легенева артеріальна гіпертензія при лівій пневмонектомії у поєднанні з моделлю МСТ. Суттєві відмінності в PAPM та RVSP між контрольною групою та групою пневмонектомії групи MCT та контрольною групою та групою пневмонектомія + Sugen. Дані представлені як середнє значення SEM. Значення р були розраховані за допомогою пост-hoc ANOVA та одностороннього тесту Тукі. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 2: Репрезентативні мікрофотографії H&E, що фарбують легеневу тканину. (ДО) Нормальна легенева тканина. У звичайній легені щура артерії (червона стрілка) відкриті, а стінки судин мають нормальний розмір. (B) Патологічне ремоделювання судин у щурів з легеневої артеріальної гіпертензії, які отримували пневмонектомію та МСТ. У легенях спостерігається вогнищевий легеневий артеріїт та запалення, концентричне медіальне потовщення стінок судин (біла стрілка) та концентричне потовщення інтими стінок судин (чорна стрілка), що призводить до сильно вузьких судин. (C.) Патологічне ремоделювання судин у щурів PAH, які отримували пневмонектомію та Sugen. У легенях також спостерігається вогнищевий легеневий артеріїт та запалення, концентричне медіальне потовщення стінок судин (біла стрілка) та концентричне внутрішнє потовщення стінок судин (чорна стрілка). Просвіти цих судин сильно обмежені або повністю закриті. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Як зазначено вище, у щурів на інших моделях ПАУ не спостерігається облітерації судин дрібних судин, неоінтимальних та плексиформних уражень та високого тиску ПА та РВ. Встановлено, що лікування хронічної гіпоксії за моделлю PAH призводить до потовщення судин, але судини залишаються відкритими, а також немає облітеруючого ураження судин та незначного запалення 5. Значення RVSP та mPAP дещо підвищені порівняно з контролем 5. Подібним чином, лікування МКТ або пневмонектомією призвело до легеневих артеріальних тисків, які не були значно вищими, ніж контрольні щури та злегка перероблені судини 7, 9 .

На відміну від цього, ліва пневмонектомія в поєднанні з МСТ або Сугеном виявилася ефективною моделлю для створення важкої форми ПАУ. Порівняно з контрольною групою, середній легеневий артеріальний тиск (MAPP) та систолічний тиск у правому шлуночку (RVSP) у щурів з важкою формою ПАУ майже подвоївся (Рисунок 1). Крім того, у цих щурів розвинулися плексиформні ураження, концентричне потовщення медіального та інтимного шарів, тромбоемболічна обструкція дистальних дрібних легеневих артерій і дуже високий легеневий артеріальний та правий шлуночковий тиск (рис. 2). ). Зіткнувшись із хронічною гіпоксією, ін'єкцією МСТ та пневмонектомією ПАГ лише в інших дослідженнях, пневмонектомія в поєднанні з МКТ або моделлю Сугена створює клінічно значущий стан. Крім того, ця модель, якщо її правильно виконати, має майже 0% інтраопераційної смертності та лише 10% смертності після одужання від відсутності правої легені для компенсації дихальної недостатності. Більш високі показники смертності під час операції або після одужання, як правило, свідчать про помилку людини чи обладнання.

Для успішного проведення лівої пневмонектомії та створення ПАУ у цьому протоколі є кілька важливих етапів, які необхідно виконати. По-перше, дуже важливо контролювати насиченість тварини киснем, капнографію та підрахунок частоти серцевих скорочень протягом усієї процедури, щоб забезпечити тварині дихання та серцебиття. Моніторинг насичення киснем ще більше підтверджує правильну інтубацію. Інтубація тварини абсолютно необхідна для цієї процедури. Коли грудну порожнину тварини відкрито, негативний тиск, який зазвичай існує в грудній порожнині, зміщується до позитивного атмосферного тиску. Таким чином, щурам необхідний позитивний тиск через штучну вентиляцію легенів. Без належної інтубації легені тварини зруйнуються від позитивного атмосферного тиску.

Нарешті, відновлення є одним з найважливіших етапів після пневмонектомії щурів. Торакотомія - це дуже болюча операція, і знеболюючі засоби мають важливе значення для сприяння адекватній вентиляції, поліпшення екскурсії легенів у післяопераційний період та зменшення болю. Щури повинні відновлюватися в положенні грудини, щоб максимізувати інфляцію легенів. Через 10 хв слідчий може зменшити частоту вентиляції, щоб стимулювати тварину самостійно дихати і прокидатися. Якщо тварина стає ціанотичною і рівень насичення киснем знижується, необхідно збільшити кисень, швидкість вентиляції та збільшити об’єм до 5 мл або більше залежно від потужності вентилятора. Екстубацію щурів слід робити якомога пізніше, як тільки тварина повністю прокинеться. Дослідник може помістити екстубованого щура в камеру з киснем, щоб текти сприяли більшому відновленню.

Якщо методика виконана правильно і вищезазначені міркування розглянуто, проведення комбінованої лівої односторонньої пневмонектомії з МСТ або Сугеном створює надійну модель важкої ПАУ, ніж лише гіпоксія, МКТ чи інші методи. Пневмонектомія успішна, тварина виживає, процедура коротка (15-30 хв), а дослідник не потребує конкретних судинних хірургічних навичок. Крім того, дослідник здатний успішно створювати ПАУ. Обмеження цього методу полягають у тому, що торакотомія є інвазивною процедурою, потрібна ендотрахеальна інтубація, а слідчому потрібні деякі загальні хірургічні навички. Неоінтимальні оклюзійні ураження легеневих судин та виражене підвищення тиску в легеневій артерії, подібне до пацієнтів із легеневою гіпертензією людини, виявляються у щурів після комбінації пневмонектомії з МСТ або ін’єкцією SU5416 7, 8, 9. Сучасна модель є надійним методом вивчення ролі легеневого переповнення в контралатеральній легені та індукованої потоком легеневої гіпертензії.

Цей протокол може бути корисним для вивчення інших захворювань. Ця модель може бути використана для вивчення компенсаторного росту легеневої тканини в контралатеральній легені. Цей метод також може бути використаний для вивчення та розробки методів лікування правошлуночкової недостатності (RVF). Сильна гіпертрофія правого шлуночка розвивається у тварин, у яких розвиваються неоінтимальні ураження з підвищеним артеріальним тиском 7. RVF спричиняє смерть приблизно у 70% пацієнтів з БАГ 13. Збільшення легеневого кровотоку може бути корисним для вивчення та розробки методів лікування пацієнтів, які страждають також на вроджені вади серця.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не мають потенційних конфліктів інтересів.