Рекомендувати документи

ліоз

Порівняльна геномна класифікація раку печінки людини Докторська дисертація

Докторська школа патології університету доктора Пала Капоші-Новака Семмельвейса

Науковий керівник: д-р Андраш Кісс, доцент, к.е.н., кандидат медицини Офіційні судді: д-р Габор Горват, д-р д-р Міклош Мозес, к.т.н. Голова екзаменаційної комісії: Члени екзаменаційної комісії:

Професор, д-р Петр Сотоні, д-р Габріелла Ленгель, д-р д-р Каролі Саймон, д-р.

Молекулярний фон гепатокарциногенезу

3.1.1 Епідеміологія первинного раку печінки людини 8 3.1.2 Патогенетична роль хронічної вірусної інфекції 12 3.1.3 Найпоширеніші генетичні відхилення від раку печінки 15 3.1.4 Найважливіші молекулярні механізми регуляції, що беруть участь у розвитку карцином печінки. 22

Транскрипційний аналіз Технологічне підґрунтя аналізу експресії на основі мікрочипів Статистичний аналіз даних мікрочипів

Роль функціональної геноміки в патогенезі раку печінки людини

в обстеженні

Аналіз експресії генів при хронічному гепатиті Аномалії експресії генів, що спостерігаються при карциномах печінки Порівняльний геномний аналіз

РНК фіксації формаліну пізніше та фіксація ацетоном Гістологічне дослідження

Зразки гепатоцелюлярної карциноми людини

5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4

Збір та обробка зразків едометрія людини

Моделі трансгенних мишей Myc та Myc/Tgfα Розробка моделі умовного нокауту тварини c-Met Виділення та лікування первинних клітин печінки мишей у культурі клітин

Інші експериментальні методи Лазерна мікродисекція Імуногістохімічне фарбування Кількісний RT-PCR-аналіз в режимі реального часу Лінійна ампліфікація РНК

Аналіз транскрипції на основі мікрочипів Маркування зразків РНК використовуваних платформ мікрочипів та гібридизація мікрочипів Статистичний аналіз даних експресії

Виправлено дослідження цілісності відновлюваної РНК та морфології тканин

у вкладених у парафін патологічних зразках

6.2 Розробка нового двокругового методу лінійної ампліфікації РНК для синтезу зразків чуттєвої РНК 6.3

Застосування ампліфікації T7T3 до лазерних мікророзсічених зразків для експресії

Ідентифікація цільових генів HGF/c-Met у первинних гепатоцитах миші

Порівняльний геномний аналіз зразків HCC людини

Роль активації шляху c-Met у регуляції рухливості клітин Роль шляху c-Met у регуляції внутрішньоклітинного окисного гомеостазу

Ідентифікація моделі експресії c-Met у карциномах печінки людини Кореляція моделі експресії c-Met, що активується, з фенотипом пухлини Встановлення прогностичної моделі на основі індукованої c-Met картини експресії

Вплив рутинної фіксації тканин на молекулярний аналіз патологічних зразків

Застосування лінійної ампліфікації РНК T7T3 при ураженнях печінки

для транскрипційного аналізу 7.3

Використання шаблону експресії гена, активованого шляхом c-MET, a

молекулярна класифікація пухлин печінки

Список таблиць та рисунків

Список власних публікацій

Власні публікації, пов’язані з дисертацією.

Власні публікації, незалежні від дисертації.

138 Помилка! Закладка не існує.

активатор урокінази плазміногену

аденоматоїдний білок поліпозу

порівняльна геномна гібридизація

фактор транскрипції, асоційований з ретинобластомою

епідермальний фактор росту

рецептор епідермального фактора росту

додаткова клітинна сигнальна активована кіназа

виражений тег послідовності

тендітний геномний локус

глікогенсинтазакіназа

поверхневий антиген гепатиту В

вірус гепатиту В.

вірус гепатиту С.

фактор росту гепатоцитів

зворотна транскриптаза людської теломерази

інсуліноподібний фактор росту

інсуліноподібний рецептор фактора росту

субстрат рецептора інсуліну

лінійний дискримінаторний аналіз

втрата гетерозиготності

залишити одноразову перехресну перевірку

мітоген-активована кіназа

багатовимірна пропорційність

мітогенна активована кіназа кіназа

мікросхема потребує мінімальної інформації для передачі експериментів

Білок для відновлення невідповідності ДНК

невідповідність - нуклеотидний зонд

безалкогольна жирова печінка

безалкогольний стеатогепатит

Національний центр біотехнологічної інформації

найближчий сусід

найближчий сусід 3

похідний тромбоцитами фактор росту

ідеальна відповідність (нуклеотидний зонд)

ретиноїновий рецептор бета

додаткова транскрипція полімеразної ланцюгової реакції

серійний аналіз експресії генів (серійний аналіз експресії генів)

нуклеотид-впливає поліморфізм

карта самоорганізації

підтримка векторної машини

трансформуючий фактор росту альфа

трансформуючий фактор росту бета

рецептор гормону щитовидної залози альфа

рецептор гормону щитовидної залози бета

тканинний інгібітор металопротеїнази

фактор некрозу пухлини альфа

ендотеліальний фактор росту судин

вірус гепатиту бабака

безкрила родина інтеграції MMTV

зміна порогу виявлення

Молекулярний фон гепатокарциногенезу

Епідеміологія первинного раку печінки людини Гепатоцелюлярна карцинома печінки людини

суттєво покращило безсимптомне виживання пацієнтів із запущеним захворюванням печінки (20). Однак група пацієнтів на проміжній стадії, яка отримує клінічну терапію (50%), далеко не однорідна. Льовет та ін. У 102 пацієнтів із циротичним ВГС, які не отримували хірургічного лікування, проаналізовано природний перебіг захворювання та розподіл факторів, що мають незалежне прогностичне значення (21). На підставі їх результатів пацієнтів з ГЦЗ можна розділити принаймні на дві підгрупи залежно від їх прогнозу. Виживання у 1, 2 та 3 років пацієнтів без клінічних симптомів (стадія 0) - 80%, 65% та 50% - було значно кращим, ніж у пацієнтів з принаймні одним клінічним симптомом (конституційний синдром, судинна інвазія, позапечінковий розкид). "29%, 16% та 8% у групі 1 стадії" (рис. 1).

Рисунок 1: Природне виживання карцином печінки. Нелікована природна виживаність хворих на ВГС на різних стадіях захворювання. На основі Льове та Брюа (21).

Патогенетична роль хронічної вірусної інфекції Як зазначалося вище, хронічні вірусні інфекції гепатиту В та С у Росії

найважливіший етіологічний фактор розвитку раку печінки (4). Тому необхідно детальніше описати їх патологічну дію. Щоб зрозуміти процес гепатокарциногенезу, необхідно розшифрувати, які елементи вірусної інфекції призводять до утворення карциноми і в який момент процес пухлини стає незалежним від вірусних факторів. 3.1.2.1

Вірус гепатиту В.

призводить до утворення мітотичних веретена (47). Секвенування ядерного транспортера Crm1 призводить до поділу клітин через накопичення в ядрі білків NfκB та mdm2 (48). HBxAg також здатний змінити схему метилювання

через його гіперметилювання (49). Окрім HBxAg, інші вірусні білки HBV також мають прямий або непрямий онкогенний ефект. У трансгенних мишей, які надмірно експресували білок оболонки HBV L, розвинулися карциноми печінки (50). Виходячи з передбачуваного патомеханізму, цитотоксичний ефект білка L та рецидив подальшої регенеративної проліферації є достатніми для ініціювання формування пухлини. Крім того, білки оболонки L і M, накопичуючись у цитоплазмі, спричиняють окислювальний та метаболічний стрес, який може бути безпосередньо мутагенним (51). 3.1.2.2

Вірус гепатиту С.

Хронічна інфекція вірусом гепатиту С є одним із найважливіших факторів ризику розвитку раку печінки як у західних країнах, так і в Японії (52). У всьому світі із 170 мільйонів серопозитивних людей до ВГС близько 132 мільйонів страждають на хронічні інфекції. Шанси розвитку HCC у носіїв HCV зростають у 17 разів, і рак печінки з часом розвивається у 2-7% пацієнтів. На інфекцію гепатиту С припадає 26–76% випадків ВГС, виявлених у Європі, та 80–90% випадків у Японії (53). Вірус гепатиту С належить до сімейства вірусів РНК флавівіридів. Оскільки він не містить ферменту зворотної транскриптази, на відміну від вірусу гепатиту В, він не інтегрується в генетичний запас зараженої клітини. Вірусні протеази (NS2-NS3) розщеплюють різні вірусні антигени (ядро, E1-E2, P7, NS2-NS3, NS4a - b, NS5a - b) з поліпротеїну, транскрибованого з геному РНК ВГС (54). Проліферацію вірусу ВГС також можна виявити при раку печінки (55). Реплікація вірусного геному

як результат, вірус присутній одночасно у вигляді різних варіантів. Серед цих варіантів типи, стійкі до імунної відповіді господаря, мають селективну перевагу та сприяють постійній інфекції та загибелі клітин печінки.

значний метаболічний стрес виникає під час реплікації вірусу в сітці (ER). Це спочатку пригнічує синтез білка і, зрештою, каспазу 12

може також призвести до загибелі клітин через її активацію. Стрес ER та пов'язаний з ним окислювальний стрес можуть призвести до злоякісної трансформації через активацію шляху кінази JUNK/p38 і, частково, через пряму генотоксичність (56). Деякі білки, кодовані вірусом HCV, також мають прямий канцерогенний ефект.

У трансгенних мишей антиген ядра HCV вперше надмірно експресується

призвело до розвитку деномів печінки, а пізніше карцином печінки (57). Основний білок здатний активувати експресію кількох генів, включаючи онкоген c-myc, що призводить до аномальної проліферації клітин. Ядро HCV активує антиапоптотичний фактор транскрипції Nf-κB. Ядро HCV також інгібує запрограмовану загибель клітин завдяки взаємодії з рецептором TNFα. Це призводить до виживання заражених клітин і сприяє розвитку хронічної інфекції (58). Прямий онкогенний ефект білка HCV NS5a проявляється шляхом зміни профілю експресії гена клітини-господаря (59). NS5a пригнічує індуковану інтерфероном противірусну відповідь у клітинах NIH 3T3 та апоптоз, індукований дволанцюговими молекулами РНК (60). Надмірна експресія неструктурних білків NS3 та NS5a у клітинах фібробластів сприяла невідповідному поділу клітин, а також сприяла розвитку пухлин у імуносупресованих оголених мишей (59). Стабільна трансфекція всього транскрипту HCV у клітинах HepG2, у свою чергу, стимулює поділ клітин та виживання клітин (61). Виходячи з усього цього, можна припустити, що ВГС здійснює свою канцерогенну дію, принаймні частково, безпосередньою активацією онкогенних шляхів.

Найпоширеніші генетичні аномалії при раку печінки Загальновідомо, що розвиваються злоякісні пухлини

послідовне накопичення генетичних змін, що впливають на проліферацію клітин та регуляторні гени клітинної смерті. Фогельштейн та ін. наше дослідження також виявляє, що для повної злоякісної конверсії необхідні дефекти принаймні чотирьох регуляторних генів (62). Відповідно, розвитку пухлин часто передує тривалий інкубаційний період та різні стадії передопухолевих уражень. Більш детальне вивчення генетичного фону гепатоцелюлярних карцином та їх історії стало можливим завдяки мікросателітній ПЛР (MSA) та порівняльній гібридизації (CGH), запровадженим у 1990-х роках. У наш час генотипування SNP та

Рисунок 2: Збільшення частоти генетичних відхилень під час прогресування HCC. Це демонструє лінійне збільшення частоти експресії теломерази, метилювання промотору, нестабільність мікросателітів та втрату алелів на послідовних стадіях гепатокарциногенезу. Заснований на Торгейрсоні та Гришамі. 3.1.3.1

Алельний дисбаланс та нестабільність мікросупутника

Короткі тандемні повтори довжиною 2-6 п.о., які широко зустрічаються в геномі, називаються мікросателітами. Їх поява та довжина демонструють значний поліморфізм серед особин і тому придатні для розрізнення окремих алелів з високою роздільною здатністю. Кожна хромосома містить в середньому близько 10000–15000 унікальних маркерів мікросупутника (66). Локалізація поліморфних повторів добре відома, і більшість людей мають маркери різної довжини на материнських та батьківських хромосомах. Таким чином, при аналізі LOH місце втрати алелю можна визначити з високою точністю. Останні методи застосовують виявлення поліморфізмів SNP на основі гібридизації для виявлення генетичних відмінностей, пов’язаних із LOH та іншими змінами числа алелів (63). Нагай та ін. Мікросателітний аналіз з високою роздільною здатністю проводили на 120 зразках HCC як пацієнтів з Азії, так і Європи, використовуючи 195 поліморфних маркерів (67). Сегменти хромосом, які найчастіше уражаються LOH a

Змінюється число хромосом

При гепатоцелюлярних карциномах хромосомна нестабільність призводить до частої втрати алелів та анеуплоїдії. Найчастіше уражаються гени - пухлини

його відсутність у шлунково-кишкових пухлинах призводить до нестабільності мікросателіт. Однак у випадку HCC ці гени не демонструють частих відмінностей, їх експресія зберігалася. Тому цілком ймовірно, що їх роль у раку печінки невелика (75).

Частота посилення (+) та видалення (-) (%)