Естер Ністаль1, Єніфер Перес-Андрес1, Олександра Р Ерран1, Альберто Камінеро4, Сантьяго Вівас3, Хосе М Руїс де Моралес2, Рікардо Вісенте Уллан6 та Хав'єр Каскейро 1,
Область мікробіології, факультет біологічних та екологічних наук, Університет Леона. Відділення 2 імунології та гастроентерології 3 лікарні Леона. 4 Інститут молекулярної, геномної та протеомічної біології (INBIOMIC) та Інститут біомедицини (IBIOMED) Campus de Vegazana, Університет Леона. 6 Інститут біотехнології Леона. Лев.
АНОТАЦІЯ
Глютен, дуже поширений компонент в раціоні людини, здатний активувати патогенез целіакії у генетично схильних осіб. Хоча роль травних ферментів людини на білки глютену дуже відома, існує значний брак знань про роль мікробіоти кишечника в його метаболізмі. Метою цього дослідження був молекулярний аналіз мікробіоти дванадцятипалої кишки, яка бере участь у метаболізмі глютену, за допомогою ПЛР-DGGE. Для цього дуоденальні біоптати дітей та дорослих культивували в культуральному середовищі (MCB), яке містило клейковину як єдине джерело азоту.
Аналіз ПЛР-DGGE показав, що в дванадцятипалій кишці мікробіоти, здатні рости в MCB, переважають Streptococcus salivarius та S. oralis. Однак були виявлені й інші роди, такі як Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella та Staphylococcus, хоча і з меншою частотою. Тому, хоча жоден електрофоретичний профіль не міг бути пов’язаний із захворюванням, спостерігається велика різноманітність дванадцятипалої кишки, які можуть брати участь у метаболізмі глютену. Потрібні додаткові дослідження для детальної характеристики мікробіоти дванадцятипалої кишки, пов’язаної з метаболізмом глютену, з метою запропонувати можливі терапевтичні альтернативи в майбутньому.
ВСТУП
Целіакія (ХД) - це хронічне запальне захворювання кишечника, яке виникає у генетично сприйнятливих осіб і викликане неадекватною імунною реакцією на білки глютену (1, 2). В даний час єдиним ефективним методом лікування CD є повне виведення глютену з раціону протягом усього життя пацієнта (3) .
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Пацієнти та зразки дванадцятипалої кишки
Культуральне середовище та умови культури
Для виділення мікроорганізмів із культури біопсії використовували розроблене в нашій лабораторії рідке середовище MCB, яке містить клейковину як єдине джерело азоту: 2 мМ CaCl 2, 2 мМ ZnSO 4, 2% глюкози, 0,1% Твін 80 (об./Об. ), 20 мкМ FeCl 3, клейковини (Sigma-Aldrich) 3% і перетравлення глютену 0,5% пепсину. РН доводили до 6,5 фосфатним буфером (1%). Середовище стерилізували в автоклаві протягом 20 хвилин при 121 ° С. Згодом за допомогою пластинчастої культури було перевірено, що середовище було абсолютно стерильним.
3% -ний дайджест глютену (100 мл) отримували інкубацією 3 г клейковини з 1 г пепсину при рН 2, регульованому HCl (10М). Суміш інкубували протягом 2 годин при 37 ° С при струшуванні (250 об/хв). Потім рН підвищували до 6,5 за допомогою NaOH (1М), а потім стерилізували при 121 ° С в автоклаві протягом 20 хвилин.
Біопсію інокулювали в колбу з 10 мл культурального середовища та інкубували протягом 48 годин при 37 ° С при струшуванні (100 об/хв) в мікроксичних умовах.
Вилучення ДНК із культур
біопсія та ампліфікація ПЛР
Видалення геномної ДНК з біопсійних культур проводили, дотримуючись вказівок протоколу комплекту екстракції ДНК тканин SpeedTools (Biotools, Іспанія). Концентрацію ДНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Saveen & Werner, Limhann, Швеція).
Для молекулярної характеристики мікробіоти дванадцятипалої кишки за допомогою ПЛР ампліфікували дві варіабельні ділянки різного розміру 16S рибосомальної ДНК для порівняння отриманих результатів з обома фрагментами. Дві пари праймерів використовували для ампліфікації генів 16S рРНК. пара олігонуклеотидів HDA1GC і HDA2 (16), які ампліфікують фрагмент приблизно 200 bp, що відповідає області V3 16S рДНК, і пара праймерів F968GC і R1401 (17), які ампліфікують фрагмент приблизно 450 bp V6- область 16S рДНК V8. Для цих підсилювачів був використаний комерційний набір iProof High-Fidelity Master Mix (BioRad). Програма ПЛР, яка була використана для цього набору, складалася з початкової денатурації 98ºC протягом 30 секунд і звідси 30 циклів із наступними температурами: 98ºC протягом 10 секунд, 56ºC або 55ºC протягом 30 секунд та 72ºC, 30 секунд. Програма ПЛР закінчувалася продовженням при 72ºC протягом 10 хвилин.
Аналіз мікробіоти, отриманої з культури дуоденальних біопсій шляхом денатураційного градієнтного електрофорезу (DGGE)
Відмінності в кількості видів між різними групами популяцій аналізували за допомогою критерію "хі-квадрат" (застосовано корекцію Йейтса). Статистичну значимість було встановлено для значень p
РЕЗУЛЬТАТИ
Молекулярний аналіз за допомогою ПЛР-DGGE
з області V3 16S рДНК
На малюнку 1 показані профілі DGGE, отримані з продуктів ПЛР в області V3 з використанням ДНК культур біопсії дванадцятипалої кишки як матриці. Різні профілі демонстрували від 1 до 5 напружених та чітко розрізнених смуг. Решта груп були слабкими або схожими на мазок. Статистично значущих відмінностей щодо кількості смуг між електрофоретичними профілями здорових осіб та профілі хворих на целіакію, як активних, так і лікуваних, не спостерігалося, а також не було різниці, пов’язаної з віком.
Було вибрано кілька смуг для їх молекулярної ідентифікації. Продукти ПЛР, які були ідентифіковані шляхом секвенування з діапазонів DGGE, наведені в Таблиці I. Для завершення молекулярної ідентифікації кожної із секвенсованих смуг був проведений філогенетичний аналіз. Частота різних видів, виявлених методом ПЛР-DGGE, наведена в Таблиці II. Серед різних ідентифікованих видів переважали Streptococcus salivarius та S. oralis, які були виявлені практично у всіх особин, як у дітей, так і у дорослих, незалежно від захворювання. На відміну від них, Bacillus cereus, Haemophilus influenza, Lactobacillus mucosae та Staphylococcus epidermidis були виявлені лише в біоптатах дітей, але з дуже низькою частотою. З культури біоптатів дорослих особин такі види, як Clostridium perfringens, Granulicatella elegans або G. adiacens, Lactobacillus crispatus та L. gasseri, також з'явилися з низькою частотою. .
Молекулярний аналіз за допомогою ПЛР-DGGE області V6-V8 з 16S рДНК
Продукти ПЛР, отримані праймерами F968GC/R1401, розділяли DGGE на 8% акриламідних/бісакриламідних гелях у градієнті денатурації 40-60% сечовини та формаміду. Як видно на малюнку 2, моделі смуг DGGE, отримані за допомогою універсальних праймерів, що відповідають області V6-V8 16S рДНК, показали дуже мало смуг (від 1 до 4 смуг), але переважна більшість була добре розв'язана. Жоден електрофоретичний профіль не може бути пов’язаний із захворюванням. Також не спостерігались відмінності щодо кількості смуг в електрофоретичних профілях дітей та дорослих, а також між здоровими та хворими.
З гелів було обрано кілька смуг для їх молекулярної ідентифікації. Продукти ПЛР, які були ідентифіковані шляхом секвенування з діапазонів DGGE, наведені в Таблиці III. Частота кожної з цих смуг показана в таблиці IV. Результати були схожі на результати, отримані з праймерами, які ампліфікують область V3, оскільки виявлені види були однаковими, з появою деяких нових. Знову ж, ампліфіковані фрагменти, що відповідають видам Streptococcus oralis та S. salivarius, з’явились практично у всіх здорових та хворих особин, незалежно від віку. Навпаки, Granulicatella elegans або G. adiacens було виявлено у 4 з 6 дітей РКД і не з’явилось у жодного здорового. Решта ідентифікованих видів мали дуже низьку частоту, оскільки вони з'явилися лише в одній або двох з аналізованих біопсій (Таблиця IV).
Фігура 1.- Профілі DGGE бактеріальних спільнот, отриманих із культури в глютенсодержащем середовищі біоптатів у дітей, що не страждають на целіакію (Non-ECN) (доріжки 1 та 2), активних дітей на целіакію (ECAN) (доріжки з 3 до 8), нецеліакія дорослі (не-ECA) (доріжки 9-16), дорослі з активною целіакією (ECAA) (доріжки 17-19) та дорослі, які лікуються целіакією (ECTA) (доріжки 20-24). Праймерами, що використовувались для проведення реакції ПЛР, були HDA1GC/HDA2. Цифри позначають фрагменти, що мають послідовності, ідентифікація яких наведена в Таблиці I
Малюнок 2.- Профілі DGGE спільнот бактерій, отриманих за допомогою біопсійної культури у безглютеновому середовищі нехворих дітей
целіакія (Non-NEC) (доріжки 1 та 2), діти з активною целіакією (ECAN) (доріжки 3 - 8), дорослі без целіакії (No-RCT)
(доріжки 9-16), активні целіакії дорослі (ECAA) (доріжки 17-19) та дорослі, які лікуються целіакією (ECTA) (доріжки
Від 20 до 24). Праймерами, що використовувались для проведення реакції ПЛР, були F968GC/R1401. Цифри позначають фрагменти з послідовністю,
ідентифікація якого наведена в таблиці III
ОБГОВОРЕННЯ
Інші роди, такі як Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella та Staphylococcus, також виявляються методом ПЛР-DGGE, хоча і з меншою частотою. Усі ці мікроорганізми характеризуються тим, що вони здатні рости на культуральному середовищі, яке містить клейковину як єдине джерело азоту. Це можна пояснити з різних причин; i) мають протеолітичну активність щодо глютену; ii) навпаки, їм не вистачає цієї активності, але вони здатні рости в цьому середовищі завдяки поживним речовинам, що надаються іншими мікроорганізмами, здатними гідролізувати клейковину; iii) або сприяє їх зростанню, оскільки вони здатні використовувати менші пептиди, що походять як наслідок часткового перетравлення клейковини пепсином. Попередні дослідження показали, що різні бактеріальні штами родів, такі як Clostridium, Lactobacillus та Staphylococcus, здатні гідролізувати клейковину (11). Отже, ці мікроорганізми можуть відігравати роль у метаболізмі глютену в дванадцятипалій кишці.
ПОДЯКИ
Ця робота фінансується проектом Інституту охорони здоров'я Карлоса III, Фондом досліджень здоров'я, що співфінансується FEDER (FIS P110/02447) та проектом Хунти де Кастилія-і-Леон, Міністерство охорони здоров'я (Посилання 520/A/10). Естер Ністал та Олександра Родрігес отримали грант від Хунти де Кастилія-і-Леон, що співфінансується Європейським соціальним фондом. Дженіфер Перес-Андрес отримав стипендію від Міністерства освіти, культури та спорту уряду Іспанії
БІБЛІОГРАФІЯ
1. Ludvigsson JF, Leffler DA, Bai JC, Biagi F, Fasano A, Green PHR та ін. Визначення в Осло целіакії та суміжні терміни. Gut 2012; 62 (1): 43-52.
2. Hill ID, Dirks MH, Liptak GS, Colletti RB, Fasano A, Guandalini S, et al. Керівництво з діагностики та лікування целіакії у дітей: рекомендації Північноамериканського товариства дитячої гастроентерології, гепатології та харчування. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005; 40 (1): 1-19.
3. Ciclitira PJ, Johnson MW, Dewar DH, Ellis HJ. Патогенез целіакії. Mol Aspects Med 2005; 26: 421-58.
4. Shan L, Molberg Ø, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM та ін. Структурна основа непереносимості глютену в целіакії. Наука 2002; 297: 2275-9.
5. Камінеро А, Ністал Е, Аріас Л, Вівас С, Коміно І, Реал А та ін. Дослідження метаболізму глютену у здорових людей показує наявність глютеназичної активності у фекаліях. Eur J Nutr, 2012; 51 (3): 293-9.
6. Гельмерхорст Е.Й., Замахчарі М., Шуппан Д., Оппенгейм Ф.Г. Відкриття нового та багатого джерела мікробних ферментів, що руйнують глютен, у ротовій порожнині. PLoS One 2010; 5 (10): e13264.
7. Zamakhchari M, Wei G, Dewhirst F, Lee J, Schuppan D, Oppenheim FG та ін. Ідентифікація бактерій Rothia як природних колонізаторів верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, що руйнують глютен. PLoS One 2011; 6 (9): e24455.
8. Nistal E, Caminero A, Herrán AR, Arias L, Vivas S, de Morales JM et al. Відмінності популяцій бактерій тонкої кишки у дорослих та дітей із целіакією та без неї: вплив віку, дієти з глютеном та захворювання. Запалення кишечника Dis 2012; 18 (4): 649-56.
9. Laparra JM, Sanz Y. Біфідобактерії інгібують запальну реакцію, індуковану гліадинами в епітеліальних клітинах кишечника, шляхом модифікації токсичного утворення пептидів під час травлення. J Cell Biochem 2010; 109 (4): 801-7.
10. Sánchez E, Laparra JM, Sanz Y. Розпізнавання ролі Bacteroides fragilis у патогенезі целіакії. Appl Environment Microbiol 2012; 78 (18): 6507-15.
11. Caminero A, Herrán AR, Nistal E, Pérez-Andrés J, Vaquero L, Vivas S, et al. Різноманітність культивованого мікробіома кишечника людини, який бере участь у метаболізмі глютену: виділення мікроорганізмів, що потенційно цікавлять целіакію. FEMS Microbiol Ecol 2014; 88: 309-19.
12. Форсберг Г., Фалгрен А, Хорштедт П, Хаммарстрем С, Гернелл О, Хаммарстрем М.Л. Наявність бактерій та вроджений імунітет кишкового епітелію у дитячій целіакії. Am J Gastroenterol 2004; 99: 894-904.
13. Collado MC, Calabuig M, Sanz Y. Різниця між каловою мікробіотою целіакії та здоровим контролем. Curr Issues Intest Microbiol 2007; 8: 9-14.
14. Nadal I, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Дисбаланс у складі мікробіоти дванадцятипалої кишки у дітей з целіакією. J Med Microbiol 2007; 56: 1669-74.
15. Sanz Y, Nadal I, Sánchez E. Пробіотики як препарати проти шлунково-кишкових інфекцій людини. Недавній препарат Pat Antiinfect Drug Discov 2007; 2: 148-56.
16. Вальтер. J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, et al. Виявлення та ідентифікація шлунково-кишкових видів Lactobacillus за допомогою денатурирующего градієнтного гель-електрофорезу та видоспецифічних ПЛР-праймерів. Appl Environ Microbiol 2000; 66: 297-303.
17. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Oyaizu H. Швидка ідентифікація кишкових біфідобактерій людини за допомогою орієнтованих на 16S рРНК видів та групово-специфічних праймерів. FEMS Microbiol Lett 1998; 167: 113-21.
18. Салліван А, Торнблом Н, Ліндберг Г., Хаммарлунд Б, Палмгрен АС, Ейнарсон С та ін. Мікрофлора тонкої кишки у стані здоров'я та хвороб. Анаероб 2003; 9: 11-4.
19. Zilberstein B, Quintanilha AG, Santos MA, Pajecki D, Moura EG, Alves PR, et al. Мікробіота травного тракту у здорових добровольців. Клініки (Сан-Паулу) 2007; 62: 47-54.
20. Fernandez-Feo M, Wei G, Blumenkranz G, Dewhirst FE, Schuppan D, Oppenheim FG, et al. Культурний мікрофлор, що руйнує глютен, через рот людини та його потенційні наслідки для целіакії та чутливості до глютену. Clin Microbiol Infect 2013; 19: E386-94.
21. Тянь Н, Вей Г, Шуппан Д, Гельмерхорст Е. Вплив ферментів Rothia mucilaginosa на структуру гліадину (клейковини), дезамінування та імуногенні епітопи, що мають відношення до целіакії. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2014; 307: G769-76.
22. Laparra JM, Olivares M, Gallina O, Sanz Y. Bifidobacterium longum CECT 7347 модулює імунну відповідь на гліадінової ентеропатії на тварині. PloS One 2012; 7: e30744.
23. Cosseau C, Devine DA, Dullaghan E, Gardy JL, Chikatamarla A, Gellatly S, et al. Комменсальний Streptococcus salivarius K12 знижує регуляцію вродженої імунної відповіді епітеліальних клітин людини та сприяє гомеостазу мікробів-господарів. Infect Immun 2008; 76: 4163-75.
24. Sliepen I, Van Damme J, Van Essche M, Loozen G, Quiryne M, Teughels W. Мікробні взаємодії впливають на реакції запальних клітин господаря. J Dent Res 2009; 88: 1026-30.
25. Sanz Y, Sánchez E, Marzotto M, Calabuig M, Torriani S, Dellaglio F. Відмінності у фекальних спільнотах бактерій у целіакії та здорових дітей, виявлені за допомогою ПЛР та денатураційного градієнтного гель-електрофорезу. FEMS Immunol Med Microbio 2007; 51: 562-8.
26. Collado MC, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Специфічні групи дванадцятипалої кишки та фекалій, пов'язані з дитячою целіакією. J Clin Pathol 2009; 62: 264-9.
27. Bernardo D, Garrote JA, Nadal I, León AJ, Calvo C, Fernández-Salazar L, et al. Чи правда, що целіакі не перетравлюють гліадин? Структура деградації гліадину при целіакії слизової оболонки тонкої кишки. Кишка 2009; 58: 886-7.
28. Arumugam M, Raes J, Pelletier E, Le Paslier D, Yamada T, Mende DR, et al. Ентеротипи мікробіома кишечника людини. Nature 2011; 473: 174-80.
29. Cocolin L, Manzano M, Cantoni C, Comi G. Аналіз денатураційного градієнтного гелевого електрофорезу області 16S рРНК гена V1 для моніторингу динамічних змін у популяції бактерій під час бродіння італійських ковбас. Appl Environ Microbiol 2001; 67: 5113-21.
30. Ван Бік S, священик Ф.Г. Еволюція молочнокислої бактеріальної спільноти під час бродіння солодового віскі: багатофазне дослідження. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 297-305.
31. Юнь Й.Х., Ім Д.С., Кан Й.Й., Кан BY, Шін Е.А., Чунг М.Дж. та ін. Ідентифікація Lactobacillus ruminus SPM0211, виділеного у здорових корейців, та його антимікробна активність щодо деяких патогенів. Arch Pharm Res 2008; 28: 660-6
32. Sainsus N, Cattori V, Lepadatu C, Hofmann-Lehmann R. Рідке культуральне середовище для швидкого вирощування хелікобактер пілорі з біопсійних зразків. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27: 1209-17.