кислоти

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • Етика
  • звір
  • Гістологічна оцінка
  • Екстракція РНК та аналіз експресії генів за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу
  • Вимірювання вмісту TG
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Характеристика мишей, яких годували HFD з експериментальними матеріалами або без них
  • Омега-3 ослаблений фіброз печінки, асоційований з NASH, та додавання UDCA ще більше посилюють його антифібротичний ефект.
  • Омега-3 та ослаблений UDCA гепатит, асоційований з NASH
  • Скупчення печінкового ТГ омега-3 та УДХК
  • Омега-3 пригнічує експресію генів, пов'язаних з ліпогенезом, і додавання UDCA посилює цей ефект.
  • Вплив UDCA на NASH був пов'язаний зі зниженням експресії iNOS мРНК
  • обговорення

предметів

реферат

Безалкогольна жирова хвороба печінки, одна з найпоширеніших хронічних захворювань печінки у світі, складається з ряду захворювань, які включають неалкогольний стеатогепатит (НАСГ). 1, 2, 3 Незважаючи на те, що простий стеатоз може зазнавати безладного природного перебігу, коли супроводжується розвиненим фіброзом печінки, він часто проходить подібний клінічний перебіг, як хронічна інфекція вірусу гепатиту С із розвиненим фіброзом. 4 Однак, з урахуванням усіх цих можливих захворювань та смертей печінки, остаточне лікування ще не знайдене, щоб зупинити або змінити прогресування захворювання.

Омега-3-поліненасичена жирна кислота (омега-3) використовується клінічно для лікування гіпертригліцеридемії. Є дані, що омега-3 пригнічує накопичення тригліцеридів у печінці (ТГ) та зменшує запалення, тим самим полегшуючи НАСГ на тваринних моделях. 6, 7, 8, 9 Однак, вагомих клінічних доказів на користь омега-3 в НАСГ бракує, хоча відсутність суттєвих побічних ефектів омега-3 робить доцільним використовувати його як добавку. 10, 11, 12

Повідомляється, що урсодезоксихолева кислота (UDCA) відіграє корисну роль в експериментальних НАСГ через її протизапальну, печінкову, захисну та антиоксидантну дію. 13, 14, 15, 16 Однак клінічні дослідження не продемонстрували суттєвого поліпшення рівня гепатиту або фіброзу у пацієнтів NASH, які отримували UDCA. 17, 18 Хоча негативні результати можна віднести до погано спланованих досліджень, включаючи неоптимальну дозу препарату та тривалість дослідження, передбачається, що поєднання UDCA з іншими агентами, такими як вітамін Е, може призвести до клінічно значущих результатів; Однак дослідження показало, що тривале споживання високих доз вітаміну Е (добова доза 400 МО) збільшує смертність. Під час тестування комбінованої терапії слід враховувати безпеку.

Реагенти, які виявляють сприятливий вплив на експериментальний NASH, часто не демонструють значного поліпшення в дослідженнях на людях. Таким чином, комбінована терапія, яка є безпечнішою та ефективнішою за будь-який із цих препаратів, може мати кращі результати в клінічних умовах. Таким чином, це дослідження мало на меті дослідити вплив омега-3 у поєднанні з UDCA на харчування, викликане NASH, у мишей, і порівняти результати з результатами омега-3, щоб оцінити можливість цієї комбінації як лікування НАСГ.

Матеріали і методи

Етика

Експериментальні процедури та протоколи на тваринах затверджені Комітетом з питань інституційного догляду та використання тварин у лікарні Кангнам-Северанс, Медичний коледж університету Йонсей (номер затвердження: 0011). Дослідження проводилось відповідно до рекомендацій та обмежень Конституційного комітету з догляду та використання тварин.

Самців мишей C57BL/6 (віком 12 тижнів) отримували від Central Lab Animal (Сеул, Корея) і поміщали на 12-годинний цикл світло-темрява. Мишей годували дієтою, що складалася з 15% безводного молочного жиру, 1,0% холестерину та 50% сахарози (дієта з високим вмістом жиру (HFD)), яку придбали у Picolab (Bethlehem, PA, USA). Цих мишей годували HFD протягом 24 тижнів, розділяли на три групи, і годували HFD окремо (HFD), HFD та 70 мг кг -1 омега-3 (Pronova Biocare, Сандефьорд, Норвегія; HFD/Омега -3) або HFD та омега-3 у поєднанні з 20 мг кг -1 UDCA (Daewoong Pharm., Сеул, Корея; HFD/Omega-3 + UDCA) протягом ще 24 тижнів. Омега-3 та UDCA розводили в 0,75% Твін-80 і вводили перорально через манометр протягом 24 тижнів. Після 48 тижнів годування HFD з або без введення експериментальних речовин мишей забивали, а їх печінку видаляли. Зразок свіжої тканини печінки фіксували у 10% забуференному формаліні, а решту тканини швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C. Зразки крові відбирали шляхом серцевої пункції після наркозу миші та зберігали при -80 ° C.

Гістологічна оцінка

Зрізи зразків тканини печінки, закріплені у 10% формаліні та вкладені у парафіновий віск, фарбували H&E та Sirius Red для гістологічної оцінки. Сліпий патолог оцінив слайди на предмет запалення, як описано в попередніх дослідженнях, з незначними змінами. 21, 22, 23 Запалення було гістологічно визначено шляхом підрахунку запальних відкладень у 20 послідовних полях великої потужності (хрусталик × 40; середня гістологічна оцінка, ступінь 0: відсутність вогнищ, ступінь 1:24. Коротко, зображення зрізів із забрудненими червоним сиріусом були зроблено зі збільшенням × 10. У кольоровій області червоним позначено фіброз, а сірим - паренхіма. Після інтерактивного визначення порогу зображення було перетворено у двійкове зображення. Вимірювальні візерунки вимірювались шляхом прямого підрахунку пікселів на двійкових зображеннях. сума площ мікроскопічних полів, які включали паренхіму та фіброз. Для кожного слайда площа фіброзу оцінювалася в 20 послідовних полях з високою пропускною здатністю, а потім усереднювалася.

Екстракція РНК та аналіз експресії генів за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу

Вимірювання вмісту TG

Вміст печінки TG визначали кількісно за допомогою комерційного набору (ab65336, Abcam, Cambridge, MA, USA) згідно з рекомендаціями виробника. Коротко кажучи, ліпідні екстракти готували гомогенізацією 50 мг замороженої тканини в 5% розчині NP-40. Гомогенізовану тканину нагрівали до 80-100 ° C на водяній бані протягом 2-5 хвилин, потім охолоджували до кімнатної температури. Зразки очищали і розбавляли (1:10) у дистильованій H 2 O, яку вимірювали при OD 570 мм відповідно до інструкцій виробника.

Статистичний аналіз

Усі результати представлені як середнє значення ± (сем). Дані аналізували непараметричним аналізом (тест Крускала-Уолліса чи Манна-Уітні) або одностороннім дисперсійним аналізом з пост-хок-аналізом Тукі. P

Зміна маси тіла протягом 48 тижнів експерименту. Всіх мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) протягом 24 тижнів, а потім розділили на три групи. Одну групу (n = 8) годували лише HFD (HFD), іншу групу (n = 8) годували HFD і отримували омега-3 (HFD/Омега-3), а іншу групу (n = 8) годували HFD і вводили омега-3 у поєднанні з UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) ще 24 тижні.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Омега-3 ослаблений фіброз печінки, асоційований з NASH, та додавання UDCA ще більше посилюють його антифібротичний ефект.

Гістологічну оцінку фіброзу печінки проводили за допомогою системи аналізу зображень фарбування Sirius Red. Введення омега-3 у добовій дозі 70 мг кг -1 з гістологічно оціненим HFD-посиленим фіброзом печінки (P 1 у поєднанні з омега-3 додатково послаблює індукований HFD фіброз печінки (P = 0,026, порівняно з омега-3 3), малюнок 2b).

Гістологічна оцінка індукованого дієтою фіброзу та запалення у NASH. Після фарбування H&E та Sirius Red проводили гістологічний аналіз печінки для оцінки запалення та фіброзу. Мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) протягом 24 тижнів, а потім розділили на три групи. Одну групу (n = 8) годували лише HFD (HFD), іншу групу (n = 8) годували HFD і отримували омега-3 (HFD/Омега-3), а іншу групу (n = 8) годували HFD і вводили омега-3 у поєднанні з UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) протягом 24 тижнів. a ) Репрезентативна гістологічна оцінка за допомогою H&E (× 100) та Sirius Red (× 100). b ) Процентна площа фіброзу. Фіброз печінки оцінювали шляхом обчислення коефіцієнта фіброзу за допомогою системи аналізу зображень. Загальна площа становила сумою площ мікроскопічних полів, включаючи паренхіму та фіброз. ( c ) Запалення було гістологічно кількісно визначено шляхом підрахунку запальних відкладень у 20 послідовних полях великої потужності (× 40 об'єктив). Середні гістологічні ступені виражаються наступним чином; ступінь 0: відсутність спалахів, ступінь 1:

Вміст тригліцеридів печінки. Вміст тригліцеридів печінки вимірювали в замороженій тканині печінки за допомогою комерційного набору. Мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) протягом 24 тижнів, а потім розділили на три групи. Одну групу (n = 8) годували лише HFD (HFD), іншу групу (n = 8) годували HFD і отримували омега-3 (HFD/Омега-3), а іншу групу (n = 8) годували HFD і вводили омега-3 у поєднанні з UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) протягом додаткових 24 тижнів. * P 27, 28 та UDCA знижують рівень iNOS при ряді запальних захворювань. 29, 30 Ми оцінили, чи сприятливий ефект UDCA на NASH у нашому дослідженні був пов'язаний зі зниженням експресії мРНК iNOS. Введення омега-3 з HFD призводило до зменшення мРНК iNOS (P = 0,012) та додавання UDCA у поєднанні з омега-3, що ще більше пригнічувало експресію мРНК iNOS (P = 0,029 порівняно з групою лише омега-3; Рисунок 3d ). ).

обговорення

Хоча кілька попередніх досліджень повідомляють, що омега-3, наскільки нам відомо, пом'якшує індукований дієтою NASH, 31, 32, 33, це перше дослідження, яке повідомляло про адитивний ефект омега-3 та UDCA на NASH. Відповідно до інших досліджень, наше дослідження також продемонструвало, що лише омега-3 може полегшити фіброз печінки, виявлений зменшенням експресії мРНК колагену α1 (I). Однак введення UDCA у поєднанні з омега-3 ще більше зменшує фіброз на рівні мРНК, а також додатково послаблює гістологічно оцінений фіброз печінки порівняно з групою, яка отримувала лише омега-3. Неодноразово вважалося, що фіброз печінки є одним з найважливіших факторів прогнозу прогресування НАСГ, 34, 35, 36, а адитивний ефект омега-3 та УДХК у зменшенні асоційованого з НАСГ фіброзу робить цю комбінацію потенційним кандидатом на лікування Лікування НАСГ.

TGFβ визначено як ключовий регулятор фіброзу печінки, який здійснює свій профіброгенний ефект через клітини печінки. 37 Про роль сигналізації TGFβ у прогресуванні NASH-асоційованого фіброзу також повідомлялося в ряді досліджень, що робить його привабливою метою лікування. 38, 39 Наше дослідження показало, що омега-3 та UDCA мали адитивний ефект у придушенні експресії мРНК TGFβ, хоча згідно з нашими результатами, TGFβ не пропонується як мішень для цієї комбінованої терапії.

Окрім фіброзу печінки, також відомо, що запалення також відіграє важливу роль у розвитку та прогресуванні НАСГ. 23, 43 Хоча введення лише омега-3 не показало значних гістологічних змін, введення УДХК у поєднанні з омега-3 призвело до гістологічно покращеного запалення, спричиненого дієтою, в НАСГ, що свідчить про адитивний ефект. Попереднє дослідження також показало знижену експресію прозапального цитокіну TNFα після прийому омега-3, що узгоджується з результатами нашого дослідження.

Відомо, що накопичення TG у печінці контролюється SREBP-1c, фактором транскрипції, який регулює ліпогенні ферменти. 45, 46 Кілька досліджень повідомляють, що добавки омега-3 зменшують експресію гена SREBP-1c, 6, 7, 8, 9, і недавнє дослідження показало, що UDCA опосередковує ліпогенез, пригнічуючи експресію SREBP-1c. 47 Наше дослідження запропонувало адитивний ефект омега-3 та UDCA на придушення SREBP-1c, хоча це дослідження не могло виявити адитивний ефект UDCA на регуляцію генів, пов’язаних з липогенезом de novo або окисленням жирних кислот.

Хоча наше дослідження не визначає механічну роль комбінованої терапії омега-3 та UDCA у покращенні НАСГ, пригнічена експресія iNOS свідчить про те, що можливим поясненням може бути зменшення пошкодження печінки окисним стресом. Збільшення вироблення iNOS було продемонстровано при індукованому фруктозою стеатозі печінки 48, а пригнічене вироблення iNOS було пов'язано із застосуванням протизапальних препаратів. У майбутньому потрібні дослідження, що вивчають більш детальні механізми.

Нарешті, наше дослідження продемонструвало адитивний ефект омега-3 та UDCA на індукований дієтою фіброз та запалення в NASH. Наше дослідження також продемонструвало адитивний ефект омега-3 та UDCA на супресію ліпогенного гена SREBP-1c та гена iNOS, пов'язаного з окислювальним стресом. Ці результати свідчать про те, що поєднання омега-3 та UDCA може бути можливим методом лікування НАСГ, хоча необхідна перевірка на різних моделях NASH та дослідження на людях.