енергії

  • Предмети
  • Резюме
  • ІНФОРМАЦІЯ:
  • ЦІЛЬ:
  • МЕТОДИ
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • ВИСНОВКИ
  • Вступ
  • Матеріали і методи
  • Тварини
  • Добова допомога
  • експериментальний протокол
  • Вміст білка в тканинах та біохімічні вимірювання
  • Ізотопні вимірювання
  • Експресія гена
  • Статистика
  • Результати
  • Споживання їжі, ріст тварин та склад тіла.
  • Сечовина плазми, гормони та амінокислоти.
  • Склад тканин, швидкість синтезу білка та експресія генів шляху протеолізу.
  • Обговорення
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація

Предмети

  • Обмін речовин
  • Ожиріння
  • Протеоліз

Резюме

ІНФОРМАЦІЯ:

Дієти з високим вмістом білка (ЛП) під час обмеження енергії були широко вивчені щодо їх здатності зменшувати жир у тілі та зберігати нежирну масу тіла, але мало відомо про їх вплив на білковий обмін у нежирних тканинах.

ЦІЛЬ:

Визначити вплив обмеження енергії та споживання білка на анаболізм та катаболізм білків у щурів.

МЕТОДИ

Протягом 5 тижнів 56 самців щурів Wistar годували дієтою з індукції ожиріння (ОІ). Потім їх піддавали обмеженню енергії на 40%, використовуючи дієту ОІ або збалансовану дієту НР протягом 3 тижнів, тоді як контрольна група отримувала дієту ОІ за умови (n = 8 на групу). Щурів, обмежених HP, розділили на п’ять груп, які відрізнялись лише джерелом білка: загальний білок молока, казеїн (C), сироватка (W), суміш 50% C і W та соя (n = 8). Тварин приносили в жертву в постпрандіальному стані та визначали склад їх тіла. Швидкості синтезу білка визначали в печінці, шлунково-кишковому тракті та нирках за допомогою повенної дози підшкірного валіну 13 C. Рівні MRNA вимірювали для ключових ферментів, що беруть участь у всіх трьох шляхах протеолізу.

РЕЗУЛЬТАТИ

Обмеження енергії, але не склад дієти, впливав на втрату ваги та ожиріння, тоді як на нежирну масу тканин (крім нирок) склад дієти не впливав. Рівні неоглікогенних амінокислот, як правило, потрапляють під обмеження енергії (Р 1, 2 передбачає змінні рівні обмеження енергії та модифікації енергетичного вмісту поживних речовин у раціонах, таких як обмеження споживання жиру або вуглеводів (СНО) та збільшення вмісту білка. 3, 4 Білки були предметом особливого дослідження завдяки їх ситному ефекту, який може зменшити споживання енергії 5 та збільшити дотримання дієтою суб'єкта. 6, 7 Крім того, дієта, багата білками, може мінімізувати втрату сухої маси тіла, що спостерігається на низькокалорійна дієта. 8, 9 Тип джерела білка також може впливати, як повідомляється на моделях гризунів. 10, 11

Метою цього дослідження було краще зрозуміти вплив дієтичного складу макроелементів, включаючи джерело білка, на склад тіла та метаболізм білків тканин під час обмеження енергії у щурів.

Матеріали і методи

Тварини

Всі експерименти проводились відповідно до керівних принципів Французького комітету з догляду за тваринами та Європейської конвенції про хребетних тварин, що використовуються для експериментів. Самці щурів Wistar (n = 56, 300-320 г) були придбані у Harlan (Horst, Нідерланди) і розміщені в контрольованих умовах навколишнього середовища (температура, темний період 12 годин, починаючи з 08:30). Щури мали вільний доступ до води та комерційної лабораторії протягом 5 днів до початку їх адаптації до експериментальних дієт.

Добова допомога

Повний розмір таблиці

Дієти подавали в напіврідкій формі, щоб уникнути розливу та покращити реєстрацію поглиненої кількості. Протягом останнього тижня обмежувального періоду щури звикли отримувати їжу за схемою, яка складалася з першого періоду з 08:30 до 09:30, який забезпечував 1/3 добового раціону, а другого періоду між 12: 00 і 18:00, що забезпечує решту раціону. Щури ОІ підлягали тому ж графіку, але мали вільний доступ до їжі між 12:00 та 18:00. Ця схема була прийнята, щоб привчити тварин їсти стандартну їжу в повному обсязі протягом 1 години експериментального дня.

експериментальний протокол

Вміст білка в тканинах та біохімічні вимірювання

Тканини ліофілізували і зважували. Загальний вміст N оцінювали методом Дюма, використовуючи елементний аналізатор (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Мілан, Італія) із атропіном як стандарт.

Загальний вміст білка (г) у тканинах визначали як P = TM ×% DM ×% N × 6,25/10 000, де TM - маса вологої тканини (g), а DM - суха речовина.

Концентрації амінокислот у плазмі крові визначали у депротеїнізованих зразках плазми шляхом іонообмінної хроматографії після колонки з дериватизацією нінгідрину (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Франція). Концентрації інсуліну та лептину аналізували за допомогою ендокринної панелі щурів (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, USA) у системі Bioplex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Концентрації сечовини визначали за допомогою комерційного набору (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Франція).

Ізотопні вимірювання

FSR (% на день) тканинних білків розраховували як FSR = Ebound val/(Efree val × t) × 100, де Ebound val і Efree val - це збагачення 13C-валіну в тканинах без білка. Абсолютні швидкості синтезу (ASR, г на добу) розраховували як ASR = FSR × P, де P - загальний вміст білка в тканині. Загальна м’язова маса оцінювалась у 45% маси тіла. двадцять

Експресія гена

Загальну РНК виділяли із замороженої тканини за допомогою реагентів TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Загальну концентрацію РНК визначали кількісно при 260 нм, а фарбування бромідом етидію використовували для підтвердження цілісності РНК. Синтез комплементарної ДНК першого ланцюга (кДНК) здійснювали в 400 нг РНК, використовуючи набір зворотної транскрипції (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Франція) з термоциклером PTC-200 (дослідження MJ, Waltham, MA, США). ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою «основного комплексу ПЛР для сибер-зеленої енергії» (Applied Biosystems) на 7300 системі ПЛР в реальному часі (Applied Biosystems). Праймери були розроблені з використанням програмного забезпечення Oligo Explorer 1.1.0 (GeneLink, Hawthorne, NY, USA). Послідовності використовуваних праймерів ПЛР: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(вперед) і 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (назад) для катепсину D (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTCTGACTACA-3 '(у напрямку назад) '-GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3 ′ (зворотний) для убиквітину (Ubb, NM_138895), 5′-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3 ′ (вперед) та 5′-ACACAACGACGATGGAAAG-3 ′ (зворотний) фермент для 14 кДа-ферменту E3-ферменту E3 для 2A (зворотний) та 5′-GAAGTAGAAGAAGGAGGTCG-3 ′ (реверс) для m-кальпаїну (NM_017116), 5′-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3 ′ та 5′-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3 ′ для 18S.

Всі реакції ПЛР проводили наступним чином: денатурація при 95 ° С протягом 10 хвилин, 40 циклів ампліфікації з кожним циклом складалися з 15 секунд при 95 ° С з наступною 1 хвилиною при 60 ° С. Поріг циклу (КТ) для кожного зразка був визначається на лінії постійного флуоресценції. Ампліфікації 18S рибосомної РНК використовувались для врахування мінливості початкових кількостей кДНК, а варіації між бляшками коригували за допомогою калібратора RT.

Експресію гена визначали за формулою 2 −ΔCt, де 2 являє собою оптимальну ефективність ПЛР та цільовий ген ΔC t = C t - C t 18S. Ефективність ПЛР визначали на кожній платівці з використанням серійного розведення РНК із зворотною транскрипцією.

Статистика

Дані виражаються як середні значення ± sd. Груповий ефект аналізували з використанням одностороннього ANOVA (версія 9.1; SAS Institute Inc., Кері, штат Північна Кароліна, США) та проводили пост-хок тести Тукі для множинних порівнянь. Ефекти обмеження енергії та рівня білка аналізували, використовуючи взірцеві контрастні твердження в групах ОІ та обмежених групах відповідно. Вплив джерела білка аналізували в групах HP-R. Для кривих зростання дані аналізували за допомогою змішаної моделі з часом як повторюваним фактором. P

Зростання щурів протягом 5-тижневого періоду ОІ та протягом 3-тижневого обмеження енергії. Середнє значення ± sd (n = 8). Для наочності представлена ​​лише одна група HP-R через відсутність різниці між обмеженими групами. * суттєво відрізняється від контролю (змішана модель з повторними вимірами, пост hoc тест Тукі). OI, контрольні щури, що годували OI ad libitum дієтою; OI-R, щури з обмеженим енергоспоживанням на дієті OI; HP-MP-R, щури з обмеженим енергоспоживанням при дієті HP, що містить загальний MP.

Повнорозмірне зображення

На склад тіла впливало обмеження енергії, тоді як склад макроелементів дієт (тобто рівень білка або джерело білка) не впливав (табл. 2). Нирка була єдиним органом, в якому рівень білка значно збільшував вагу. Обмеження енергії зменшило жирові прокладки, тоді як на нежирні тканини обмеження енергії впливало лише незначно. Не було відмінностей у складі тіла між різними обмеженими групами, незалежно від рівня та природи вмісту білка в їх раціоні.

Повний розмір таблиці

Сечовина плазми, гормони та амінокислоти.

Метаболіти та гормони плазми вимірювали через 2 год після їжі (табл. 3). Уремія була на 64% вищою у щурів HP, ніж у щурів OI (P

Концентрація амінокислот у плазмі крові, на яку впливали обмеження енергії, рівень білка та/або джерело білка. Середнє значення ± sd (n = 8). РО, контрольні щури, які годували РО дієтично (чорна смужка); OI-R, щури з обмеженим енергоспоживанням на дієті OI (відкритий бар); HP-R, щури з обмеженим енергоспоживанням за дієтою HP (сірі смуги) з білками з різних джерел (MP; W; CW; C; S). Основні статистичні ефекти вказані на кожному графіку: обмеження енергії (ER), рівень білка (PL), джерело білка (PS).

Повнорозмірне зображення

Склад тканин, швидкість синтезу білка та експресія генів шляху протеолізу.

Вміст білка, FSR та ASR у печінці, шлунково-м’язовому м’язі та нирках представлені в таблиці 4. Результати у всіх групах HP-R були об’єднані через відсутність будь-якого впливу джерела білка. Обмеження енергії та рівень білка не впливали на вміст білка та потоки синтезу білка в цих тканинах, оцінених за допомогою FSR або ASR.

Повний розмір таблиці

У печінці дієта не модулювала експресію катепсину D, убиквітину, ферменту Е2 та м-кальпаїну (рис. 3). На відміну від цього, рівні РНК генів, що беруть участь у шляхах протеолізу, значно підвищувались за рахунок обмеження енергії в нирках та зменшувались за рівнем білка в дієтах з обмеженим використанням енергії для всіх чотирьох ферментів. Також спостерігався ефект джерела білка на убиквітин, фермент Е2 та М-кальпаїн, з тенденцією до вищого рівня експресії в групі МП порівняно з Cas та S. У м’язах шлунково-кишкового тракту експресія генів протеолізних ферментів катепсин D), як правило, збільшується з обмеженням енергії, тоді як рівень HP різко знижує експресію всіх чотирьох ферментів.

Відносна експресія генів шляху протеолізу (катепсин D, убиквітин, фермент Е2, m-кальпаїн) у печінці, шлунково-м’язовому м’язі та нирках у щурів після обмеження енергії протягом 3 тижнів. Середнє значення ± sd (n = 8). РО, контрольні щури, які годували РО дієтично (чорна смужка); OI-R, щури з обмеженим енергоспоживанням на дієті OI (відкритий бар); HP-R, щури з обмеженим енергоспоживанням за дієтою HP (сірі смуги) з білками з різних джерел (MP; W; CW, суміш C і W; C; S). Основні статистичні ефекти вказані на кожному графіку: група, обмеження енергії (ER), рівень білка (PL), джерело білка (PS).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Це дослідження показало, що у щурів, які зазнали обмеження енергії на 40-45%, втрата ваги та склад тіла в основному перебували під впливом обмеження енергії, тоді як склад раціону та джерело білка не мали значних ефектів. Рівень HP покращив циркуляцію глюкози та ліпідів у крові, тоді як обмеження енергії лише зменшило кількість вільних жирних кислот. Рівень HP протидіяв тенденції до збільшення циркулюючих неоглікогенних амінокислот в результаті обмеження енергії. На швидкість синтезу білка не впливали ні обмеження енергії, ні рівень білка в їжі, тоді як у нирках та м’язах ключові ферменти протеолізу надмірно експресувались при обмеженні енергії та погано виражались при підвищенні рівня білка. Однак ці модуляції шляхів протеолізу не впливали на втрату нежирної маси, незалежно від вмісту білка в раціоні.

На закінчення видно, що у дорослих щурів із ожирінням, яким протягом 3 тижнів було обмежено енергію на 40%, їх вага та втрата жиру визначалися лише споживанням калорій, незалежно від складу макроелементів. М'ясна маса зберігалася незалежно від рівня білка, і на білковий обмін впливав лише незначно, за винятком шляхів протеолізу в м'язах та нирках, де будь-якій постпрандіальній активації за рахунок обмеження енергії протидіяв рівень НР. Нарешті, коли рівень білка був високим, усі джерела білка були рівнозначні за своїм ефектом.