Предмети

Резюме

Вступ

Тут ми вивчаємо вплив Cav на орієнтацію ліпідного плота каналів Kv1, аналізуючи функцію можливого збереженого мотиву CBD у сімействі Shaker. І Kv1.3, і Kv1.5 націлені на ліпідні плоти, але лише Kv1.3 ефективно взаємодіє з Cav через CBD, де ця асоціація необхідна для локалізації каналів у цих доменах. Крім того, поведінка та активність Kv1.3 були зумовлені наявністю Cav1. Отже, наявність CBD поблизу Т1 Kv1.3 має важливі функціональні наслідки для фізіології каналу Kv1.3.

Результати

Диференціальна кавеолінова залежність перегородки Kv1.3 та Kv1.5 ліпідних плотів

взаємодії

Загальні білкові лізати HEK Cav1, отримані через 24 години після трансфекції зазначеним каналом (міченим YFP), імунопреципітували проти кавеоліну. Зразки відокремлюють SDS-PAGE та імуноблотують (IB) проти GFP (канал) та антитіла до кавеоліну. ( ДО ) Принципові схеми усічених каналів Kv1.3 та химер Kv1.3-Kv1.5. Домени Kv1.3: білі бочки і чорні лінії. Домени Kv1.5: сірі бочки та сірі лінії. ( B ) Вихідні матеріали. Верхня панель, фільтри були іммуноблотовані проти GFP (канали). Нижня панель, фільтри тестували проти Cav, щоб продемонструвати імунопреципітацію Cav. ( C. ) Імунопреципітати. Імунопреципітації не спостерігалося за відсутності антитіл (ІР-).

Повнорозмірне зображення

Кавеолін 1 взаємодіє з Kv1.3 через підпис CBD, розташований на N-кінці каналу

Ізоляти ліпідних плотів, виготовлені в HEK Cav- (ліва панель) та HEK Cav1 (права панель), що експресують Kv1.3CBD ( ДО ) і мутантних каналів Kv1.5CBD ( B ) (166 FQRQVWLLF 174 - AQRQVGLLA та 232 FQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240 відповідно). ( C. ) HEK Cav1, що експресує Kv1.3 або Kv1.3CBD, імунопреципітували проти кавеоліну (IP: Cav1) у присутності (+) та відсутності (-) антитіла до кавеоліну. Зразки відокремлювали SDS-PAGE та імуноблотували проти Kv1.3 (IB: Kv1.3) та кавеоліну (IB: Кавеолін) SM: вихідний матеріал; SN: супернатант; ПІ: імунопреципітат.

Повнорозмірне зображення

Ми не виявили взаємодії між Kv1.5 та Cav1; однак, при перетворенні передбачуваного Kv1,5 CBD до показника Kv1,3 (Kv1,5I239L), ми спостерігали позитивну Cav1-коімунопреципітацію Рис. S4. Крім того, дані свідчать про те, що Kv1.5 міг опосередковано взаємодіяти з кавеолінами шляхом утворення надмолекулярних комплексів, включаючи SAP97 33, 34. SAP97 (асоційований із синапсом білок 97) є членом сімейства асоційованих з мембраною гуанілаткіназ (MAGUK), що також включає PSD95 (білок постсинаптичної щільності 95). Тому ми експресуємо Kv1.5 у присутності та відсутності PSD95 у клітинах HEK Cav1. У цьому сценарії Kv1.5 спільно імунопреципітували з Cav1, лише у присутності PSD95 (рис. S4). Отже, наші дані свідчать про те, що хоча повна цілісність Kv1.3 CBD є достатньою для взаємодії з Cav1, Kv1.5 вимагає допоміжних білків.

Обговорення

Докази показують, що Kv1.3 націлений на конкретні місця мембрани 35, 36, а зміщення розташування мають патологічні наслідки 37. У нашому дослідженні висвітлено основний механізм розділення мембранної поверхні каналу Kv1.3. Тут ми повідомляємо, що серед каналів Kv1 (Shaker) лише Kv1.3 та Kv1.5 суттєво націлені на ліпідні плоти. Однак, хоча плавучість Kv1,5 не залежала від експресії кавеоліну, концентрація ліпідних плотів Kv1,3 зростала залежно від дози кавеоліну. Це має фізіологічне значення, оскільки це було підтверджено у BMDM від мишей Cav1 -/-. Крім того, колокалізація каналу кавеоліну була вищою з Kv1.3, ніж з Kv1.5. Нарешті, ми чітко ідентифікували CBD, який знаходиться в N-кінцевому домені Kv1.3 і є елементом, відповідальним за взаємодію Cav1 та розташування ліпідного плоту каналу. Оскільки орієнтація ліпідних плотів була запропонована як механізм регулювання іонних каналів, 1, 38 наші результати сприяють цьому розширюваному полю.

Підсумовуючи, наші результати допомагають з’ясувати механізми, які спрямовують канали Kv1 до конкретних поверхневих мікродоменів, які беруть участь у точній настройці клітинних реакцій. На відміну від інших нейрональних каналів Kv1, Kv1.3 взаємодіє з кавеоліном через CBD, розташований у N-кінцевому домені каналу, що прилягає до першого трансмембранного сегмента, і в безпосередній близькості від домену T1 та сайту зв'язування Kvβ. Ця асоціація спрямовує Kv1.3 на кавеолярні структури, які регулюють як динаміку, так і активність мембрани каналу.

Методи

Експресійні плазміди та сайт-спрямований мутагенез.

Щур Kv1.3 в pRcCMV був наданий TC Holmes (Каліфорнійський університет, Ірвін, Каліфорнія). Щури Kv1.1 та Kv1.4 у pGEM7 та людські Kv1.5 у конструкціях pBK були субклоновані у pEYFP-C1 та pECerulean-C1 (Clontech). Химери Kv1.3/Kv1.5 генерувались у каналах pEYFP-rKv1.3 та pEYFP-hKv1.5 шляхом вставки сайтів BglII та EcoRI в N та C домени терміналу каналів. Мутанти генерували за допомогою наборів для мутагенезу, спрямованих на сайт QuikChange (Stratagene). Послідовність LoopBAD (BAD, домен акцептора біотину) була вставлена ​​в першу позаклітинну петлю pEYFP-Kv1.3 в межах вже існуючого сайту NruI для конструкції rKv1.3LoopBAD. Лігазу біотину E. coli, що містить конструкцію pBtac_BirA, використовували, як описано раніше 54. Щур Cav 1 у pECerulean-C1 був наданий JR Martens (Медична школа Університету Флориди). Cav1 вводили в pcDNA3 шляхом перетравлення Cav-pECerulean (HindIII-BamHI). Конструкції були перевірені шляхом послідовності.

Культура клітин, тимчасові трансфекції та ізоляція плотів.

Клітини HEK 293 вирощували в DMEM, що містить 10% FBS і 100 ОД/мл пеніциліну/стрептоміцину (Gibco). Перехідна трансфекція проводилася за допомогою Metafectene ™ Pro (Biontex) при майже 80% злиття. Макрофаги, отримані з мишачого кісткового мозку, були виділені, як описано раніше [55]. Усі експерименти та хірургічні протоколи проводились відповідно до керівних принципів, затверджених Комітетом з етики Університету Барселони відповідно до Директиви 86/609 CEE Ради Європейського Співтовариства.

Виділяли нерозчинні в тритоні комплекси низької щільності, як описано раніше 18, 20. Клітини гомогенізували в 1 мл 1% Triton X-100, і сахарозу додавали до кінцевої концентрації 40%. Лінійний градієнт сахарози від 5 до 30% поміщали зверху і додатково центрифугували (39000 об/хв) протягом 20-22 годин при 4 ° C у роторі Beckman SW41. Градієнтні фракції (1 мл) збирали зверху та аналізували вестерн-блот.

Екстракція білка, ко-імунопреципітація та Вестерн-блот-аналіз.

Клітини, промиті холодним PBS, лізували на льоду розчином NHG (1% Triton X-100, 10% гліцерину, 50 ммоль/л HEPES pH 7,2, 150 ммоль/л NaCl) з додаванням 1 мкг/мл апротиніну, 1 мкг/мл лейпептину, 1 мкг/мл пепстатину та 1 мМ фенілметилсульфонілфториду для інгібування протеаз. Гомогенати центрифугували при 16000 × g протягом 15 хвилин і вміст білка вимірювали за допомогою білкового аналізу Bio-Rad.

Для імунопреципітації зразки попередньо очищали 30 мкл білків білків А-сефарози протягом 2 годин при 4 ° С, обережно перемішуючи в рамках процедур спільного імунопреципітації. Потім кульки видаляли центрифугуванням при 1000 xg протягом 30 с при 4 ° C. Зразки інкубували протягом ночі з анти-кавеоліновим антитілом (4 нг/мкг білка) при 4 ° C з легким струшуванням. До кожного зразка додавали тридцять мікролітрів білка A-сефарози та інкубували протягом 4 годин при 4 ° C. Гранули видаляли центрифугуванням при 1000 xg протягом 30 с при 4 ° C, чотири рази промивали NHG і ресуспендували в 100 мкл Laemmli Буфер SDS.

Зразки білка (50 мкг), фракції плоту (50 мкл) та імунопреципітати кип'ятили у завантажувальному буфері SDS Леммлі та розділяли 10% SDS-PAGE. Потім зразки переносили на мембрани PVDF (Immobilon-P, Millipore) і блокували 5% Tween 20 PBS з додаванням 5% сухого молока. Потім фільтри іммуноблотували специфічними антитілами: анти-GFP (1/1000, Roche), антикавеолін (1/2, 500, BD Biosciences), анти-Kv1,3 (1/500, Neuromab), антиклатрин (1/1000, BD Biosciences), антифлотилін (1/1000, BD Biosciences). Нарешті, фільтри промивали 0,05% Твін 20 PBS і інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (BioRad).

Імуноцитохімія, плазматична мембрана (ПМЛ) та трансмісійна електронна мікроскопія.

Клітини HEK, висіяні на покритих покриттями, оброблених полі-D-лізином, використовували через 24 год після трансфекції (Metafectene Pro). Клітини промивали в PBS (вільний від K + фосфатний сольовий розчин) і фіксували 4% параформальдегідом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (RT). Для виявлення Cav 1 клітини пермеабілізували, використовуючи 0,1% Triton X-100 протягом 10 хв. Через 60 хв у блокувальному розчині (10% козячої сироватки (Gibco), 5% нежирного сухого молока, PBS) клітини обробляли кролячими антикавеоліновими антитілами (1/100, BD Biosciences) у 10% козячої сироватки. 0,05% Triton X-100 та інкубують знову протягом 1 години. Після 3 промивань препарати інкубували протягом 45 хвилин з кон’югованим антитілом Alexa-Fluor-555 (1: 500; Молекулярні зонди), промивали та монтували в Mowiol (Calbiochem). Всі процедури проводили в RT.

Препарати ПМЛ отримували осмотичним шоком з незначними модифікаціями 29. Коротко кажучи, клітини охолоджували на льоду протягом 5 хв і двічі промивали в PBS. Потім клітини інкубували протягом 5 хвилин у 1/3 KHMgE (70 мМ KCl, 30 мМ HEPES, 5 мМ MgCl2, 3 мМ EGTA, рН 7,5) і обережно промивали нерозведеним KHMgE, щоб викликати гіпотонічний шок. Розбиті клітини видаляли з покривного скляного шару за допомогою піпетки вгору та вниз. Після двох промивань буфером KHMgE залишалися приклеєними лише листи мембрани. ПМЛ фіксували свіжим 4% параформальдегідом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і встановлювали в монтажному середовищі Mowiol.

Для передавальної електронної мікроскопії ПМЛ обробляли так, як це було зроблено для імуноцитохімії, але візуалізували за допомогою різних вторинних антитіл. Kv1.3 було розпізнано мишачим антитілом до Kv1.3 (1/20, Neuromab). Козячі анти-мишачі та кролячі антитіла, кон'юговані з частинками золота 10 нм та 15 нм, розпізнавали Kv1.3 та Cav1 відповідно. Коротко, оброблені зразки додатково фіксували 2,5% глутаральдегідом у PBS протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім зразки ліофілізували, промивали та кріозахищали 10% метанолом. Потім зразки піддавали криогенному швидкозаморожуванню (BAF-060, Bal-Tec) протягом 90 хвилин при -90 ° C і тиску 10–7 мбар. Репліки отримували обертанням (136 об/хв) випаровуванням платини 1 нм через електронну гармату (під кутом 23 °). Це було посилено випаровуванням вуглецю 10 нм (під кутом 75 °). Репліки відокремлювали від зразка, використовуючи 30% плавикову кислоту. Нарешті, зразки промивали і встановлювали на стелажах, покритих Formvar.

Резонансна передача енергії Фестера (FRET)

FRET проводили у акцепторній конфігурації фотовідбілювання. Зображення були зроблені за допомогою конфокального мікроскопа Leica SP2. Зображення були отримані до і після відбілювача YFP із зануреною об'єктивом 63 × при збільшенні 4. Збудження проводилося через лінії 458 та 514 нм Ar-лазера та використовували емісійні фільтри. Смуговий пропуск 473–495 та 535–583 . Ефективність FRET (FRETeff) розраховували за рівнянням:

де, F D після: донорський флуоресцентний (церулевий) після і F D перед акцепторним відбілювачем (YFP). Аналіз проводили за допомогою ImageJ.

Відновлення флуоресценції після фотоелектричного відбілювання (FRAP) та відстеження окремих частинок (SPT)

Експерименти проводили, як описано раніше 46, 54, 56. Для експериментів FRAP був використаний мікроскоп Olympus FV1000. Коротко кажучи, YFP вибілювали протягом 250 мс за допомогою 30% 515 нм Ar-лінійного лазера, а флуоресценцію контролювали до і після відбілювання за допомогою масляного об'єктива PLAPO 60x NA 1: 1, 40 із збільшенням 4, що отримували кожні 108 секунд. Придбання було здійснено за допомогою лазерної лінії 1% 515 нм Ar та смугового емісійного фільтра 525–560 нм.

Електрофізіологія

Були проведені експерименти з установки пергаментно-струбцинових клітин, як це було зроблено в 49. Щоб викликати струми, що залежать від напруги, клітини стимулювали квадратними імпульсами 250 мс в діапазоні від -60 до +80 мВ з кроком 10 мВ. Інактивацію типу С вивчали, застосовуючи тривалий імпульс 5 с при +60 мВ. Пікову амплітуду (pA) нормували, використовуючи значення ємності (pF). Аналіз даних проводили за допомогою програм FitMaster (HEKA) та Sigma Plot 10.0 (Systat Software). Усі записи були зроблені в RT.