предметів

реферат

Головний

Макроавтофагія (далі - аутофагія) є надзвичайно консервативним катаболічним процесом і бере участь у різних клітинних функціях. Це відбувається у фізіологічних умовах на базальному рівні і відіграє роль у клітинному гомеостазі, розкладаючи погано зібрані білки та пошкоджені органели. Матеріал, що піддається руйнуванню, виділяється у везикулах, відомих як аутофагосоми, які з часом асоціюються з лізосомами. Автофагія диференційовано регулюється при старінні, а також бере участь у патофізіологічних процесах, включаючи рак. 1, 2, 3 Канонічна аутофагія реагує на подразники навколишнього середовища за допомогою різних факторів, які належать насамперед до гомологів генів (atg), які спочатку ідентифікуються у дріжджах. Двома основними регуляторами, що регулюють канонічну аутофагію, є мішень для ссавців комплексу рапаміцину (mTOR) 1 (mTORC1), який негативно регулює аутофагічну активність, та комплексу фосфатидилінозитол-3-кінази Beclin1/III (PI3K). Класи, необхідні для зародження аутофагосомної мембрани. Розширення мембрани здійснюється двома убіквітин-подібними системами кон'югації (ATG12-ATG5 та ATG8/LC3) та членами сімейства білків ATG18 WD з 1-3 доменами взаємодії фосфоїнозитидів (WIPI1-3) (регуляція аутофагії добре оцінена в посилання 7).

Однак нещодавно були виявлені неканонічні автофагічні шляхи, які відрізняються від канонічних сигналів тим, що вони не обов'язково вимагають ієрархічної дії білків ATG та білкових комплексів. Наприклад, негалонічні аутофагічні шляхи, незалежні від комплексу Beclin1 або mTORC1 та ULK1, відомі як 9, 10, 11, 12, але в підсумку всі вони призводять до злиття аутофагосом з лізосомами та деградації субстратів у цих кислих відділах.

Відповідно до складності описаних дотепер аутофагічних шляхів, у патофізіологічних процесах є численні наслідки аутофагії. Автофагія впливає, наприклад, на раннє формування пухлини та підтримку пухлини, а також на ефективність терапевтичного втручання. 13, 14, 15, 16 Змінена експресія білка ATG та змінена аутофагічна активність були виявлені в різних тканинах раку - від стовбурових клітин гліобластоми до клітин раку молочної залози. Нещодавно було показано, що ко-шаперон Bcl-2-асоційований атаноген 3 (BAG3), який модулює вікову аутофагічну активність, зменшує селективність аутофагії через селективну аутофагію і сильно виражається у нейробластомі, позитивному до рецепторів естрогену, та раку молочної залози клітин. 17, 18, 19, 20, 21

У цьому дослідженні ми надаємо докази того, що ERα запускає неканонічну аутофагію, незалежну від зв’язування лігандів та його опосередкованої ERE транскрипційною активністю активності в різних усталених ER-експресуючих моделях пухлинних клітин та тканинах раку молочної залози людини. Ми показали, що зменшення аутофагічної активності нокдауну BAG3 та блокування лізосомної деградації сенсибілізують α-позитивні клітини ER до стресу. Детальний аналіз аутофагічного шляху, показаний тут, може відкрити нові стратегії в лікуванні ER-позитивних клітин раку α-молочної залози, які не реагують на лікування АЕ або інгібіторами ароматази.

результат

Експресія ER диференційовано регулює транскрипцію генів, пов’язаних з аутофагією

ER - це або фактори транскрипції, які взаємодіють безпосередньо з елементами реакції естрогену (ERE) та через взаємодію з іншими факторами транскрипції, або активують цитоплазматичні сигнальні каскади. Оскільки ER α та β зазвичай коекспресуються, диференціальний аналіз функції кожного рецептора є експериментальним завданням. Ми використовували добре охарактеризовану клітинну лінію нейробластоми (SK-N-MC) без експресії ER, стабільно трансфікованого фальшивою плазмідою (SK-01), рецептором естрогену α (SK-ER α) або рецептором естрогену β (SK-ER β) . ). 28, 29, 30 Ці клітинні лінії дозволяють вивчати диференційну функцію ER в клітинах пухлини в контрольованих та добре описаних умовах. 21, 28, 30, 31, 32, 33, 34 Крім того, ми також використовували похідну від пацієнта клітинну лінію раку молочної залози MCF-7 як ER-позитивну модель раку молочної залози, що експресує ERα, але не ERβ. Всі клітинні лінії були охарактеризовані для експресії ER методом ПЛР-аналізу (додаткова фігура 1а). Як описано вище, експресія ЕР, а також підвищена аутофагічна активність сприяють метастатичному потенціалу та стійкості до лікування різних типів раку. 18, 35

рецептор

Рецептори естрогену диференційовано регулюють експресію генів, пов’язану з аутофагією. ( a ) Загальну РНК із клітин SK-01, SK-ER α, SK-ER β та MCF-7 характеризували за допомогою бібліотеки Human Autophage Primer 1 (HATPL-1) та порівнюючи клітини, що експресують ER, з фальшиво трансфікованими плазмідними контролями ( SK-01). Червоні цифри вказують на регулювання, що перевищує 1,5 рази, сині цифри означають зниження норми, що перевищує 1,5 рази, темно-червоні цифри означають значення Р

Далі ми дослідили, чи зниження рівня ERα в клітинах MCF-7 змінює аутофагічну активність, але нокдаун ER і суттєво не змінює рівень аутофагічного потоку або експресії BAG3. Зрозуміло, що залишкова кількість експресії ERα після нокдауну RNAi все ще є достатньою, щоб відіграти свою роль у збільшенні неканонічної аутофагії (додатковий малюнок 5b). Ця інтерпретація підтверджується спостереженнями, що тимчасово надмірна експресія ERα в ER-відсутніх нативних клітинах SK-N-MC (попередники β-клітин SK-01, SK-ER та SK-ER) призводить до збільшення аутофагічного потоку та збільшення білка BAG3. рівні (додатковий малюнок 5b).

Щоб підтвердити, що наші знахідки щодо підвищеної експресії автофагічних маркерів в клітинах ER α відображають підвищений аутофагосомний біогенез, а не знижений автофагосомний кліренс, ми використали вектор експресії (ptfLC3), що кодує LC3, злитий з червоним флуоресцентним білком (RFP) і зеленим флуоресцентним білком (GFP) в тандемі (GFP-RFP-LC3). Ми показали, що всі клітинні лінії демонструють червоні флуоресцентні пункції без відповідного сигналу в зеленому каналі в умовах контролю, що свідчать про інтактне злиття аутофагосом з лізосомами. Відповідно до результатів вестерн-блоттінгу на малюнках 2a та b, ми спостерігали посилене накопичення аутофагосом у ER-позитивних клітинах (малюнок 3a). Кількісне визначення пунктирів GFP-RFP-LC3 у кожній клітинній лінії (рис. 3b) додатково підкреслює наші висновки та демонструє значно більші кількості утворення аутофаголізосом у клітинах, що експресують ERα.

Інгібування пізньої фази аутофагії BafA 1 призводить до збільшення клітинної загибелі в клітинах, що експресують ER, і під впливом окисного стресу, викликаного H 2 O 2. Клітини SK-01, SK-ER та, SK-ER та MCF-7 обробляли контрольною групою носія або 400 мкМ та 600 мкМ H 2 O 2 з BafA 1 (або без) (500 нМ) або без неї протягом 24 годин, і загибель клітин визначали кількісно методом проточної цитометрії після фарбування йодидом пропідію. Значення трьох незалежних експериментів у кожній панелі виражаються як середнє значення ± SEM, а репрезентативні дані експериментів наводяться у профілях діаграми розсіювання FACS. (*) на стовпцях представляє статистичну значимість P 2, 17, 21, 47 Нокдаун BAG3 супроводжувався зниженням рівня LC3-II після лізосомального інгібування в ER-позитивних клітинах ER і меншою мірою в клітинах SK-01, що вказує на те, що зниження регуляції BAG3 суттєво погіршує автофагічний потік (малюнки 6а-в). Цікаво, що за допомогою нокдауну BAG3, опосередкованого siRNA та лікування H 2 O 2, ми не виявили змін у загибелі клітин у контрольних клітинах, але значне збільшення чутливості в клітинах, що експресують α α (рис. 6d-f), які в цілому були навіть вищими ніж після пригнічення аутофагії лікуванням BafA 1 (Рисунки 5b до).

Моніторований ефект BAG3 на виживання клітин можна пояснити його роллю в аутофагії, але також може бути обумовлений його антиапоптотичними функціями. Вважається, що ці рецептори регулюються взаємодією BAG3 з антиапоптотичним фактором BCL2, що веде до захисту клітин від апоптотичної загибелі клітин, 53. в той час як BAG3 також було встановлено, що послаблює протеотоксичність, що призводить до індуцибельної стійкості в пухлинних клітинах. Далі повідомляється, що апоптоз клітин пухлини індукується замовчуванням BAG3 і посилює індукований наркотиками апоптоз новоутворених клітин. 56, 57 Далі повідомлялося, що BAG3 впливає на інтенсивні шляхи, регульовані шляхами білка теплового шоку 70 (HSP70), які також пов'язані з виживанням ракових клітин та апоптозом. 58

Відповідно до наших нещодавніх результатів, результати протеомічного аналізу продемонстрували роль BAG3 та основного білка Vault як ефективних факторів виживання, що сприяють хіміотерапевтичній стійкості клітин раку молочної залози. 59

Існує обмежена кількість даних про біомаркери та цільові білки, які, як правило, передбачають ефективність інгібіторів аутофагії при раку молочної залози. Тому потрібна ефективна аутофагова дисекація. Впровадження аутофагічних мереж та індивідуальних "слідів аутофагії" для пацієнтів може потенційно покращити ефективність медикаментозної терапії аутофагічного шляху, оскільки можна використовувати спеціалізований канонічний препарат проти канонічної аутофагії, що залежить від mTOR/PI3K. Це являє собою головну проблему для персоналізованого розвитку медицини та біомаркерів, а також нову терапевтичну можливість для онкологічних хворих.

Матеріали і методи

Культура клітин

Клітини людини SK-N-MC (ATCC HTB-10) та клітини MCF-7 отримували з американської колекції клітин і культивували, як описано вище. Всі реагенти для обробки розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО) і використовували з наступними концентраціями та інтервалами часу: 10 нМ 17β-естрадіолу (Е2, Sigma-Aldrich, Зельце, Німеччина) протягом 24 годин; 1 мкМ ICI 182780 (Tocris Biosciences, Брістоль, Великобританія) протягом 24 годин; 500 нМ бафіломіцину А1 (Enzo Life Science, Фармінгдейл, Нью-Йорк, США) протягом 6 годин; супутнє лікування 1 мкМ Вортманіну (Sigma-Aldrich) та 100 нМ бафіломіцину А1 протягом 20 годин та 50 мкМ U0126 (Promega, Madison, WI, США) протягом 48 годин. У разі подвійного лікування проводили 1 годину. Попередня обробка інгібуючим агентом.

трансфекція

За методом фосфатного кальцію клітини висівали в 6-лункові планшети за 24 години до трансфекції. Всі реагенти відрегулювали до кімнатної температури (RT) і 10 мкг плазмідної ДНК або 20 мкг siRNA змішали з 105 мкл H 2 O і 15 мкл CaCl 2 і інкубували протягом 5 хвилин. Всього додавали 120 мкл 2x буфера HEPES і інкубували протягом 30 хвилин. Суспензію переносили безпосередньо в середовище і через 24 години додавали свіжу середу. Для візуалізації аутофагічної активності використовували плазміду GFP-RFP-LC3 (ptfLC3, Addgene, Cambridge, MA, USA). Ще через 24 години клітини збирали або піддавали імуноцитохімії. Генерація pIRES-ER α та pIRES-ER β були описані вище 29, 30, а плазміда pIRES була придбана у Clonetech Laboratories (Mountain View, CA, USA).

Для опосередкованої siRNA надмірної експресії та нокдауну клітини трансфікували, використовуючи фосфат кальцію або метод FuGENE (Promega). Деталі наведені в додатковій інформації. Величезна siРНК (5'-AUUCUCCGAACGUGUCACG-3 ') була придбана у вигляді siMAX у MWG. міРНК проти BAG3 постачала Sigma-Aldrich (SASI_Hs02_00337266). суміш міРНК anti-DRAM1 постачала MWG (No 1: 5'-ACACCUCCAGAGAGUGUGGUA-3 '; No 2: 5-GGAUUAUGUAUAUCACGUA-3').

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано вище. 2 Аналіз проводили за допомогою системи Fusion-SL 3500 WL (Peqlab, Ерланген, Німеччина) та програмного забезпечення Aida Image Analyzer v.4v26 (Raytest, Straubenhardt, Німеччина).

імуноцитохімія

Клітинну імуноцитохімію проводили, як описано вище. 2 Вкладені в парафін зразки пухлини депарафінізували, а потім регідратували ксилолом з подальшим зменшенням кількості спиртів (100% до 70% спирту). Регідратацію припиняли інкубацією з найбільш переважним H 2 O, а зрізи зберігали у воді до виявлення антигену. Потім проводили імунофарбування, як описано вище. 2 Клітини та тканини аналізували мікроскопічно з використанням перевернутого Leica TCS SP5 (Вецлар, Німеччина) та метаконфокального мікроскопа Zeiss LSM710 (Оберкохен, Німеччина), а зображення обробляли за допомогою Adobe Photoshop CS5 (Сан-Хосе, Каліфорнія, США) та Leica LAS AF (Leica Microsystems (UK) Ltd, Мілтон-Кейнс, Великобританія). Формування плям GFP-RFP-LC3 (візуалізація з використанням вищевказаної експресійної плазміди GFP-RFP-LC3) визначали кількісно, ​​підраховуючи плями на конфокальних лазерних скануючих мікроскопічних зображеннях, що відповідають трансфікованим клітинним лініям, та після обробки бафіломіцином А1 (500 нМ, 6 год). принаймні 56 клітин на клітинну лінію.

Трансмісійна електронна мікроскопія

Підготовку зразків та аналіз електронної мікроскопії проводили, як описано вище, 63, і зображення обробляли за допомогою Adobe Photoshop CS5.

антитіла

Антитіла, використані для імуноцитохімії, а також для вестерн-блот-аналізу в цьому дослідженні, були такими: ATG7 (8558, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA); BAG3 (ab47124, Abcam, Кембридж, Великобританія); BCL2 (sc-492, Санта-Крус, Даллас, Техас, США); ERa (RM9101S0, Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс, США); ERK1/2 (9102, Технології стільникової сигналізації); p-ERK1/2 (9106, Технології стільникової сигналізації); LC3B (L7543, Sigma-Aldrich); mTOR (OP97, Millipore, Billerica, MA, США); p-mTOR S2448 (ab51044, Abcam); NBR1 (00004077-M01, Абнова, Тайбей, Тайвань); SQSTM1 (GP62-C, Progen, Гейдельберг, Німеччина); PI3K клас III (4263, технології стільникової сигналізації); Тубулін (T9026, Sigma-Aldrich); WIPI1 (HPA007493, Sigma-Aldrich); Беклінль (ab51031; Abcam); p70S6K (9202, сигналізація стільникового зв’язку); p70S6K Thr389 (9206, сигналізація стільникового зв’язку). Вторинними антитілами були антитіла проти миші/кролика/морської свинки, кон'юговані з DyLight 488, 649 та Cy3 (імунофлуоресценція, Jackson ImmunoResearch, Вест-Гроув, Пенсільванія, США) або HRP (імуноблотинг, Jackson ImmunoResearch).

Тканина раку молочної залози людини

Зразки пухлини раку молочної залози людини були отримані хірургічним шляхом у онкологічних хворих. Детальніше про хворих на рак можна знайти в Додатковій таблиці 1. Інформована згода була отримана від усіх випробовуваних, і дослідження були схвалені Інституційними експертними комісіями та Комітетом з етики Спільного центру з пухлинних герантів (UCT) Франкфуртського університету.

ПЛР, ПЛР зворотної транскрипції та кількісна ПЛР у режимі реального часу

ПЛР та кількісну ПЛР у реальному часі проводили, як описано вище 21, використовуючи HATPL-1 (Biomol, Гамбург, Німеччина) згідно з протоколом виробника. Оглядові зміни та значення P цільових генів у клітинах SK-ER α, SK-ER та MCF-7 порівняно з клітинами SK-01 обчислювали за допомогою шаблону аналізу даних масиву ПЛР RT 2 Profiler v4.0 від Qiagen (Venlo, The Нідерланди)). Всі вісім генів, завантажених на матричну пластину, використовувались як вісім внутрішніх контролів. Змінюються лише гени з багаторазовим згином, ніж +1, 5 або -1,5 та значенням Р Р 64). Трансфекцію проводили, як описано вище. Через 24 год клітини стимулювали 17 β-естрадіолом (10 нМ) та/або ICI (1 мкМ) протягом 24 год. Згодом клітини збирали за допомогою системи аналізу люциферази (Promega, кат. № E4030). Концентрації білка визначали BCA, як описано вище, і показники люмінесценції визначали в автоматичному лічильнику (Wallac Victor2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Експерименти з трансфекції проводили у трьох примірниках, повторювали тричі та нормалізували для ідентичного білка.

Експерименти з виживання методом сортування клітин, активованих флуоресценцією (FACS)

За 24 години до стимуляції клітини SK-01, SK-ER α, SK-ER β і MCF-7 висівали в 24-лункові планшети. Після 1 години попередньої інкубації з бафіломіцином A 1 (500 нМ) або ДМСО клітини обробляли контролем носія, 400 мкМ або 600 мкМ H 2 O 2 (Sigma-Aldrich), протягом 24 годин. Після обробки супернатант з клітин збирали і клітини розчиняли з планшетів за допомогою розщеплення трипсином і знову інкубували з попередньо зібраним супернатантом. Після 5 хв центрифугування (800 г) клітини розщеплювали в 100 мкл PBS. Всі кроки виконувались на льоду. Життєздатність клітин вимірювали фарбуванням клітин йодидом пропідуму (PI) (1 мкг/мл). Флуоресценцію PI визначали за допомогою проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Популяції клітин попередньо вимірювали за допомогою прямого розсіювання (FSC-Height) та бічного розсіювання (SSC-Height). Потім результати аналізували за допомогою програмного забезпечення BD CellQuest Pro Analysis.

Статистичний аналіз

Кількісні дані виражаються як середнє значення ± SEM. Статистичне порівняння між експериментальними групами проводилось за допомогою t-критерію Стьюдента. Значення ймовірності P ≤ 0,05 вважали значущими.