предметів

реферат

Порушення печінкової абсорбції глюкози (ГГУ) викликає постпрандіальну гіперглікемію при цукровому діабеті 2 типу. Тут ми показали, що знижена активність печінки Sirt2 погіршує HGU у мишей з діабетом, що страждають ожирінням. Надмірна експресія Hepat Sirt2 збільшує HGU у мишей з цукровим діабетом із ожирінням та полегшує їх толерантність до глюкози. Зниження рівня печінкової сірки2 у мишей, які не страждають від діабету, знижує HGU і спричиняє порушення толерантності до глюкози. Sirt2 сприяє підвищенню глюкози HGU, дезацетилюючи регуляторну білок глюкокіназу K126 (GKRP). Глюкокіназа та GKRP-глюкозозалежна дисоціація важливі для HGU, але інгібуються в гепатоцитах, отриманих від ожирілих діабетичних мишей, виснажених Sirt2 або трансфікованих мутантами, що імітують ацетилювання GKRP. Мутанти, що імітують деацетилювання GKRP, дисоціюють від глюкокінази глюкозозалежним способом у гепатоцитів, що походять від мишей із діабетом, що страждають ожирінням, та підвищують толерантність до HGU та глюкози у мишей із діабетом, що страждають ожирінням або дб/дб Ми показали, що залежне від Sirt2 деацетилювання GKRP покращує порушення HGU, і припускаємо, що це може бути терапевтичною мішенню для діабету 2 типу.

Постпрандіальна гіперглікемія тісно пов'язана з підвищеним ризиком серцево-судинних ускладнень та летальності при цукровому діабеті 2 типу 1, 2, 3. Поглинання печінкової глюкози (ГГУ) становить третину екзогенного споживання глюкози, що переноситься їжею 4, а порушення ХГУ при ожирінні та цукровому діабеті 2 типу спричиняє гіперглікемію після їжі 5, 6. Повідомляється, що неправильна активація печінкової глюкокінази відповідає за пошкодження HGU при цукровому діабеті 2, 5, 7 типу, проте точний механізм HGU та активація пошкодження глюкокінази ще потрібно з'ясувати.

Глюкокіназа відіграє важливу роль у HGU 8 після їжі. Глюкокіназа каталізує фосфорилювання глюкози до глюкозо-6-фосфату, тоді як протилежна реакція каталізується глюконеогенним ферментом глюкозо-6-фосфатаза (G6Pase). HGU заснований на балансі між глюкокіназою та G6Pase 9, але активність печінкової G6Pase істотно не змінюється до 90 хвилин після їжі. Різке підвищення активності печінкової глюкокінази у відповідь на підвищення рівня глюкози в крові після їжі в основному зумовлене посттрансляційним механізмом, що залежить від регуляторної білкової глюкокінази (GKRP) 8. GKRP пригнічує активність глюкокінази, зв'язуючись з ферментом, а глюкоза дисоціює GKRP від ​​глюкокінази, активуючи тим самим глюкокіназу 8, 11. Маломолекулярні глюкокінази-GKRP, що сприяють дисоціації зв'язування глюкокінази-GKRP із зниженням рівня глюкози в крові у мишей із діабетом, що страждають ожирінням 12, що вказує на важливість GKRP у підтримці гомеостазу глюкози в крові. Однак роль GKRP у пошкодженні HGU при діабеті 2 типу залишається незрозумілою.

Ми виявили, що виснаження NAD + бере участь у пошкодженні HGU у мишей з діабетом, що страждають ожирінням, і що Sirt2 відіграє важливу роль у цьому процесі завдяки деацетилюванню GKRP. Крім того, обмежене деацетилювання GKRP, залежне від Sirt2, знижує толерантність до HGU та глюкози, а надмірна експресія Sirt2 або мутація GKRP, що імітує мімоцетилювання, покращує пошкодження HGU та покращує толерантність до глюкози у мишей з діабетом, що страждають ожирінням.

результат

Відновлення NAD + збільшує HGU у мишей з діабетом, що страждають ожирінням

шляхом

Нокдаун Sirt2 запобігає NAD + залежним HGU

Деацетилювання GKRP сприяє дисоціації глюкокінази-GKRP

Деацетилювання K126 на GKRP відіграє важливу роль у поглинанні глюкози, залежному від NAD +/Sirt2. a - c Вплив опосередкованої аденовірусом надмірної експресії печінки дикого типу GKRP-K126R або GKRP-WT на мишей печінки G-knockdown Sirt2 на рівень глюкози в крові (n = 5) ( a ), плазмовий інсулін (n = 5) 5) ( b ) і надходження 2-дезоксиглюкози (2-ДГ) у печінку, ВАТ та скелетну мускулатуру (n = 4) ( c ) після введення глюкози (2 г/кг). d - f Вплив опосередкованої аденовірусом надмірної експресії печінки GKRP-K126Q або GKRP-WT у мишей з високим вмістом жиру (HFD), які отримували NMN, на рівень глюкози в крові (n = 5) ( d ), плазмовий інсулін (n = 5) ( e ) та поглинання 2-DG у печінці, WAT та скелетних м’язах (n = 4) ( f ) під час введення глюкози (1 г/кг). * P

Оскільки HGU регулюється як глюкозою, так і інсуліном 4, незалежний від інсуліну ефект толерантності до глюкози NAD +/Sirt2 може частково бути відповідальним за глюкозозалежну регуляцію HGU, що також включає глюкокіназу та GKRP. У дослідженнях із використанням ко-імунопреципітації та міток hAG/Ash, GKRP був розроблений як прямий цільовий білок для Sirt2. Потім ми виявили, що нокдаун Sirt2 та надмірна експресія призвели до збільшення та зменшення ацетилювання GKRP у первинних гепатоцитах, припускаючи, що Sirt2 деацетилює GKRP. Експресія гена Gck печінки була збільшена після нокдауну печінки Sirt2 і знижена після надмірної експресії Sirt2 в печінці. Ці зміни можуть призвести до недооцінки впливу Sirt2 на регулювання HGU. Оскільки нокдаун Sirt2 не впливав на експресію гена Gck у первинних гепатоцитах, ці зміни в експресії гена Gck в умовах нокдауну та надмірної експресії Sirt2 можуть бути обумовлені зміною рівня інсуліну в плазмі, що корелювало з чутливістю до інсуліну.

Мас-спектрометрія та дослідження мутантних GKRP показали, що K126 GKRP є цільовим місцем деацетилювання Sirt2. Ацетилювання GKRP прогресує в печінці мишей, що харчуються HFD, тоді як ацетилювання GKRP послаблюється в db/db гепатоцитах миші та печінці, що надмірно експресує печінку K126R. Це свідчить про те, що K126 зазнає підвищеного ацетилювання внаслідок зниження активності Sirt2 в печінці з діабетом із ожирінням. Ацетилювання GKRP все ще мало змін після введення глюкози та мінімальне збільшення після ревакцинації у худих мишей, але нокдаун Sirt2 призвів до збільшення ацетилювання GKRP у худих мишей. Ці висновки вказують на те, що активності Sirt2 достатньо для деацетилювання GKRP у печінці нежирних мишей, навіть в умовах голодування та повторного годування. Ацетилювання GKRP включає не тільки деацетилазу, але й ацетилтрансферазу. Детальний механізм, який лежить в основі незначної зміни ацетилювання GKRP після ревакцинації, незрозумілий, але може включати ацетилтрансферазу. Дослідження на клітинах HeLa визначило p300 як ацетилтрансферазу, відповідальну за ацетилювання K5 GKRP 24, але необхідне подальше дослідження для виявлення механізму ацетилювання K126, виявленого в нашому дослідженні.

Дослідження in vivo вказують, що деацетилювання GKRP K126, залежне від Sirt2, відіграє важливу роль у патогенезі HGU та порушень толерантності до глюкози в печінці із цукровим діабетом із ожирінням. Оскільки мутація GKRP (K126Q), що імітує ацетилювання, пригнічує глюкозозалежну глюкокіназу - дисоціацію GKRP і зменшує поглинання 2-DG у гепатоцитах, отриманих від мишей, миші, що імітують ацетилювання GKRP (K126Q), печінки демонструють знижений рівень печінкового 2-DG порушення толерантності до глюкози та стійкості до ЯМН-залежного покращення ускладненого печінкового поглинання 2-ДГ та непереносимості глюкози у мишей, що годували HFD із ожирінням. З іншого боку, через те, що глюкозозалежна глюкокіназа - дисоціація GKRP була відновлена, а поглинання 2-ДГ посилено шляхом надмірної експресії мутантного GKRP-мутанта (K126R), що імітує деацетилювання, у гепатоцитах db/db, отриманих мишами, трансдукція GKRP (імітація деацетилювання) у печінці мишей, що годувались HFD, та мишей db/db збільшили поглинання 2-ДГ у печінці та покращили толерантність до глюкози та резистентність до інсуліну, навіть незважаючи на їх рівень печінкового НАД +. Крім того, печінкова трансдукція K126R подолала печінкову індуковану нокдауном Sirt2 порушене всмоктування печінки 2-DG та непереносимість глюкози.

Це дослідження показало, що NAD +/Sirt2 важливі для регуляції HGU і що Sirt2 допускає глюкозозалежну дисоціацію глюкокінази з GKRP шляхом деацетилювання K126 GKRP. У мишей з діабетиком із ожирінням, що харчуються HFD, та мишей db/db, активність Sirt2 зменшується зі зменшенням вмісту печінкового NAD +, що посилює ацетилювання GKRP та погіршує HGU. Більше того, ми виявили, що деацетилювання K126 GKRP полегшує порушення толерантності до глюкози та резистентності до інсуліну у мишей, хворих на HFD, що страждають ожирінням, та мишей db/db. Ці результати свідчать про те, що регулювання деацетилювання GKRP, залежне від NAD +/Sirt2, відіграє важливу роль у контролі HGU, і що ця регуляція є новою терапевтичною мішенню при цукровому діабеті 2 типу та ожирінні та відповідає за порушення HGU.

методи

Культура клітин

Біохімічний аналіз

Рівні NAD + та 2-DG у первинних гепатоцитах та зразках тканин вимірювали за допомогою набору для кількісного визначення NAD/NADH (BioVision, Mountain View, CA) та набору для вимірювання поглинання 2-DG (Cosmo Bio, Токіо, Японія) відповідно.

Тестування на толерантність до глюкози

Для внутрішньоочеревинних тестів на толерантність до глюкози мишам внутрішньочеревно вводили 1 г/кг ваги глюкози для мишей, що годували HFD, і 2 г/кг ваги глюкози для мишей, що годували НХ, з або без постійного внутрішньовенного введення соматостатину (3 мкг/кг/хв) (Sigma) через яремний катетер за 1 год до введення глюкози. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра GLUCOCARD (Arkray, Кіото, Японія) та комерційного колориметричного набору (Wako). Рівні інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою набору Імуноферментного аналізу мишачого інсуліну (Shibayagi, Gunma, Японія).

Гіперінсулінеміко-гіперглікемічне затискання

Дослідження гіперінсулінеміко-гіперглікемічних затискачів проводили через 4–7 днів після каналізації, як описано раніше із змінами 28. Гіперінсулінеміко-гіперглікемічне затискання проводили у неспаних і нестримних мишей, що голодували протягом ночі. Під час дослідження затискача через яремний катетер вводили інсулін (1,25 мО/кг/хв) (Eli Lilly, Індіанаполіс, Індонезія) та соматостатин (3 мкг/кг/хв) із змінною кількістю 40% розчину глюкози для підтримки рівень глюкози в крові на рівні 280 ± 30 мг/дл. Через 50 хв протягом 1 хв внутрішньовенно вводили 2-DG (200 мкмоль/кг), а через 10 хв після введення 2-DG отримували зразки м’язів печінки, WAT та підошви для аналізу поглинання 2-DG.

Кількісна ПЛР

Кількісну ПЛР проводили, як описано раніше 29. Загальну РНК виділяли із заморожених зразків тканин або клітин за допомогою системи виділення загальної РНК SV (Promega). кДНК синтезували із загальної РНК за допомогою набору реактивів PrimeScript RT (Takara Bio, Otsu, Японія). Кількісну ПЛР проводили за допомогою набору SYBR Select Master Mix (Life Technologies) з 36B4 як контрольного гена. Послідовності праймерів, що використовуються в цьому дослідженні, доступні за запитом (36B4, Gck [який кодує глюкокіназу] та G6pc [який кодує G6Pase]).

Вестерн-блот та імунопреципітація

Вестерн-блот проводили, як описано вище. Тканини печінки та культивовані клітини гомогенізували в крижаному реактиві лізису клітин CelLytic MT (Sigma) з інгібіторами протеази. Імунопреципітацію проводили з використанням ацетильованих K антитіл, кон'югованих з білком Dynabeads G (Life Technologies), або кон'югованих магнітних кульками антитіл Flag tag. Антитіла, використані для імунопреципітації мітки Flag, ацетильованого K GKRP та ацетилированного K кератину 8, були магнітними кульками проти DYKDDDDK (1E6, 10 мкл/мг білка; Wako), анти-AcK (# 9441, 0,2 мкл/мг білка; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) та anti-AcK (ab21623, 0,2 мкл/мг білка; Abcam, Кембридж, Великобританія) відповідно. Для імуноблотингу були отримані наступні антитіла: анти-Sirt2 (sc-20966, 1: 500), анти-глюкокіназа (sc-7908, 1: 500), анти-GKRP (sc-11416, 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology ), анти-Sirt1 (07-131, 1: 1000; Millipore, Billerica, MA), анти-Flag (F1804, 1: 1000), анти-β-актин (A5441, 1: 1000) (Sigma), анти- HA (3F10, 1: 1000; Roche), анти-Halo (G9281, 1: 1000; Promega) та анти-кератин 8 (TROMA-I, 1: 200; Дослідження розвитку Hybridoma Bank, Iowa City, IA). Імуноблот-зображення кількісно визначали за допомогою денситометрії на приладі LAS-3000 (Fujifilm, Токіо, Японія). Нерозрізані зображення репрезентативних імуноблотів показані на додатковому рис. 9.

Вектори аденовірусу

Аденовірусні вектори (Sirt2 з позначкою прапора, Sirt2 з міткою HA, глюкокіназа з міткою прапора, глюкокіназа з міткою HA, глюкокіназа, мітками GKRP, мітками K126R GKRP, мітками K126Q GKRP та U6) були сконструйовані аденовірусом Комплект подвійного виразу (Takara Bio). Аденовірусний вектор, що кодує позначений прапором Sirt1, був наданий T Kitamura (Університет Гунма). Ізольовані гепатоцити мишей та мишей використовували для кожного експерименту відповідно через 24 год та 3-4 дні після трансфекції аденовірусу. Миші отримували аденовіруси (5,0 × 10 8 одиниць, що утворюють наліт) у хвостову вену.

Аналіз білково-білкової взаємодії

Взаємодія між Sirt2 та GKRP або глюкокіназою аналізували за допомогою флуоресцентної системи для виявлення білково-білкових взаємодій (MBL, Нагоя, Японія), яка виявляє білково-білкові взаємодії як флуоресцентні вогнища. Гепатоцити трансфікували векторами Sirt2, GKRP, або глюкокіназою, міченими phAG, та векторами Sirt2, GKRP або глюкокіназою, міченими pAsh, за допомогою реагенту Lipofectamine 3000 (Life Technologies). Внутрішньоклітинні флуоресцентні вогнища спостерігали за допомогою флуоресцентного мікроскопа (FSX100; Olympus, Токіо, Японія).

Аналіз мас-спектрометрії GKRP

Цілісноклітинні лізати клітин HEK293, трансфіковані GKRP з міченим прапором, імунопреципітували антитілом до мітки DYKDDDDK (Wako). Злитий білок елюювали пептидом DYKDDDDK (Wako) та повторно імунопреципітували анти-AcK (технологія клітинної сигналізації). Імунопреципітат розчиняли на градієнті 4-12% градієнта SDS-PAGE і білкову смужку піддавали мас-спектрометричному аналізу за допомогою MS Bioworks (Ann Arbor, MI). Для аналізу мас-спектрометрії сполук у цій статті див. Додаткову рисунок 5.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення. Статистичні методи не використовувались для визначення обсягу вибірки до експерименту, який натомість базувався на попередніх даних та попередніх публікаціях. Тварин виключали з експериментів, якщо вони мали якісь ознаки хвороби. Дисперсійну однорідність досліджували за допомогою критерію Левена для кількох груп або F-тесту для двох груп. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію Стьюдента для порівняння двох груп та одностороннього ANOVA з пост-hoc-тестом PLSD Фішера для порівняння кількох груп. Відмінності вважалися значними при Р