товстої

  • реферат
  • мета:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • результат
  • Генерація CD44-позитивних клітинних ліній колоректального раку
  • Клітини Р6С експресують гени штаму
  • Самообновлення та диференціація клітин Р6С
  • Хромосомна нестабільність та мутації р53 у клітинах Р6С
  • Голоконова ксенотрансплантатна пухлина, отримана з однієї клітини
  • Резистентність до ліків клітин Р6С
  • обговорення
  • Внесок автора
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткове зображення S1
  • Додаткове зображення S2
  • Додаткове зображення S3
  • Додаткове зображення S4
  • Додаткове зображення S5
  • Додаткове зображення S6

реферат

Стовбурові клітини раку здатні ініціювати та підтримувати ріст пухлини. У цьому дослідженні ми встановили лінію стовбурових клітин колоректальної карциноми CD44 + з особливим акцентом на її здатність до самовідновлення, збільшення ініціації пухлини та стійкість до лікарських засобів.

методи:

Свіжий рак товстої кишки та парні нормальні тканини товстої кишки були зібрані у 13 пацієнтів, які не проходили хіміо- або променеву терапію до операції. З 6 клонів, отриманих з однієї клітини, культивували лише клітинну лінію Р6С протягом 20 пасажів у серійній культурі та утворювали високоефективні голоклони з подальшою експресією генів штамових штамів, утворенням колоній, пухлинністю та препаратом чутливість на клітинній лінії Р6С. були обстежені.

результати:

Білкові штами, включаючи c-Myc, Oct3/4, Nanog, Lgr5 та SOX2, були високо експресовані в клітинній лінії P6C. Позитивні клітини P6C, що містять жовтень 3/4, здебільшого генерують голоклони симетричним поділом, тоді як невелика кількість клітин P6C генерує мерклони асиметричним поділом. Клітини P6C стабільно експресували CD44 і мали високу здатність утворювати пухлинні сфери. Одноклітинна куля змогла генерувати пухлини ксенотрансплантата у оголених мишей. Порівняно з клітинами колоректальної карциноми SW480 та HCT116, клітини P6C були високо стійкими до камптотецину та 5-фторурацилу, що зазвичай використовуються хіміотерапевтичних засобів для лікування колоректального раку.

висновок:

Ми розробили лінію стовбурових клітин раку товстої кишки та прямої кишки P6C з високою пухлинною здатністю та нормальними характеристиками стовбурових клітин. Це буде корисно для механічних досліджень стовбурових клітин раку та розробки препаратів, які конкретно націлені на ракові стовбурові клітини.

результат

Генерація CD44-позитивних клітинних ліній колоректального раку

Ми зібрали свіжі тканини раку товстої кишки та спарили нормальні тканини товстої кишки у 13 пацієнтів, які не проходили хіміо- або променеву терапію до операції. Тканини подрібнювали в DMEM і інкубували з 1 мг/мл колагенази та 1 мг/мл гіалуронідази протягом 1 години. Суспензію клітин висівали в колби розміром 25 см 2, що містять DMEM, доповнену 10% FBS, та ультрафіолетові пластинки, що містять DMEM, доповнену 5% FBS. Клітини товстої і прямої кишки від восьми пацієнтів утворювали сфери в надтонких прикріплювальних посудинах (Corning, №3262) протягом 25 днів (рис. 1А). На відміну від них, за однакових культурних умов клітини, виділені з парних нормальних тканин товстої кишки, не утворювали жодних сфер. Натомість нормальні клітини товстої кишки зазнали обмеженого поділу клітин до старіння (рис. 1А). Потім ми виділили окремі ракові клітини з бісеру та імплантували ці клітини з концентрацією 0,5 клітини на лунку в 96-лункову платівку. Чотири клони, отримані з однієї клітини (з назвами P6C, P7C, P8C, P13C-1, P13C-2 та P13C-3), були генеровані з чотирьох пацієнтів. З них лише лінію Р6С культивували протягом 20 пасажів у серійній культурі та утворювали високоефективні голоклони 14, 15 (рис. 1А).

90%, коли клітини вирощували на планшетах (малюнок 1D). На відміну від них, рівні експресії диференційованих маркерів епітеліального кишечника, включаючи CDX2, цитокератин 1 (CK1) та CK20, були низькими, коли клітини вирощувались в умовах культивування сфероїдів, і значно зростали після прикріплення. Це свідчить про те, що клітини P6C у сфероїдах зберігають недиференційований стан і зазнають певного ступеня диференціації в міру зміни культурних умов (рис. 1D). Порівняно з клітинною лінією P6C, диференційована клітинна лінія колоректальної карциноми SW480 демонструвала низьку експресію CD44, високу експресію CK20 і була позитивною для експресії CDX2 (рис. 1D).

Поліпшення клоноутворення є однією з характеристик CSC. Коли 100 клітин імплантували в 6-лункову платівку, ми спостерігали, що з клітинної лінії Р6С генерується більше клонів, ніж з клітинних ліній HCT116 та SW480; ця різниця в кількості клонів була значною (рис. 1Е). Ці дані свідчать про те, що клітинна лінія Р6С здатна до самообновлення та диференціації, що є характеристикою стовбурових клітин.

Клітини Р6С експресують гени штаму

Експресія стовбурового гена в клітинах P6C. (А) Імунофлуоресценція стовбурових білків у культивованих клітинах Р6С. Сфери P6C дисоціювали, висівали на покривні склянки і залишали на 3 год. Після фіксації клітин параформальдегідом клітини інкубували із зазначеними антитілами. DAPI використовувався для фарбування ядерних лічильників. Шкала, 100 мкм. (B) Експресія гена стебловості, виявлена ​​вестерн-блот. Клітини P6C стабільно трансфікували конструкцією промотора pOct3/4-EGFP (OPG). Цілий клітинний лізат клітин HT29, HCT116, SW480, P6C та P6C-OPG наносили рівномірно, піддавали SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозні мембрани. Потім мембрани інкубували із зазначеними антитілами та візуалізували за допомогою системи ECL. (C) Вплив CD44-хРНК на експресію жовтня 3/4 у клітинах P6C. Відносну активність промотору Oct3/4 вимірювали за допомогою інтенсивності флуоресценції GFP, виявленої за допомогою проточної цитометрії. В якості контролю використовували Р6С та батьківські клітини. Кожен зразок проводили у трьох примірниках і експеримент повторювали тричі. b P

Симетричний та асиметричний поділ клітин Р6С. (А) Активація промотору Oct3/4 у клітинах P6C та SW480. Клітини P6C та SW480 стабільно трансфікували конструкцією промотору pOct3/4-EGFP. Активацію промотора Oct3/4 та експресію CD45 вимірювали за інтенсивністю флуоресценції за допомогою проточного цитометра. (B) Самовідновлення позитивної клітини P6C Oct6/4. Одну позитивну клітину P6C Oct3/4 висівали в 6-лункову платівку і спостерігали під мікроскопом. Фотографували кожні 24 години, щоб виявити утворення голоцену. Шкала, 50 мкм. (C) Асиметричний поділ позитивної клітини P6C Oct3/4. Мероклон з однієї позитивної клітини P6C Oct3/4 зазнав асиметричного поділу в клітинах 2 стадії. Фотографії робили кожні 24 години. Шкала, 50 мкм. (D) Різні мероклони, параклони та голоклони, отримані з позитивних клітин Oct3/4. Морфологія клітин у частково позитивному клоні Oct3/4 (зверху) показала щільну адгезію позитивних клітин Oct3/4 та розслаблену взаємодію негативних Oct3/4-клітин клітин. Два клони поруч один з одним, що вказує на те, що параклон є Oct3/4-негативним, а голоклон - Oct3/4-позитивним (знизу). Шкала, 200 мкм.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Самозбір та диференціація є характерними рисами стовбурових клітин. Щоб зрозуміти їх роль у клітинній лінії P6C, ми імплантували окремі клітини P6C-OPG у 96-лункову платівку та спостерігали їх поділ під мікроскопом. Більшість oct3/4-позитивних ракових клітин зазнали симетричного поділу, утворюючи GFP-позитивні клітини голоклону (87%), як показано на малюнку 3B, тоді як лише 13% клітин P6C генерували мерклони асиметричним поділом (малюнок 3C). Невеликий відсоток (

0,5%) Oct3/4-негативних клітин змогли диверсифікуватися в Oct3/4-позитивні клітини при посіві в надтонкі посуди (дані не наведені). Ми також помітили, що експресія жовтня 3/4 сильно корелювала з морфологією клітин. Всі параклони були жовтнево-негативними, тоді як усі голоклони, що спостерігалися, складалися з жовтнево-позитивних клітин. У мероклоні клітини, що експресують жовтень 3/4, міцно прилипали, тоді як клітини, негативні для жовтня 3/4, вільно контактували, як це спостерігалося під фазово-контрастним мікроскопом (рис. Ці спостереження надалі підтверджують гіпотезу про те, що клітини Р6С мають критичні властивості самовідновлення та диференціації. Крім того, жовтень 3/4 може бути маркером колоректального КСК, які мають більший потенціал для симетричного поділу, ніж пропонувалося раніше 16 .

Хромосомна нестабільність та мутації р53 у клітинах Р6С

Однією з ключових особливостей ракових клітин у порівнянні з нормальними клітинами є хромосомна нестабільність, яка вважається критичною для ініціювання туморогенезу 17; однак точна роль, яку відіграє геномна нестабільність у ініціюванні CSC, залишається незрозумілою. Тому ми були зацікавлені в дослідженні геномної цілісності клітинної лінії Р6С. Як показано на малюнку 4А, 73% клітин Р6С мали 59 хромосом. Була одна копія хромосом 3, 4, 9, 13, 14 і 15 та три копії хромосом 7, 12, 20 і 22. Хромосомні транслокації також були поширеними в цій клітинній лінії разом із хромосомними вставками та делеціями (Малюнок 4А). Ці дані вказують на те, що клітинна лінія Р6С страждає хромосомною нестабільністю та аномальним мітозом, що є загальними рисами ракових клітин.

Каріотип та мутації клітин p53 P6C. (А) Репрезентативний каріотип клітин Р6С. Приблизно 73% клітин Р6С мали 59 хромосом. Кожну хромосому фарбували різним кольором за допомогою аналізу FISH. (B) Мутація від 72P до 72R в алелі p53 клітин P6C (пасаж 120). КДНК p53 була зворотно транскрибована з мРНК і клонована у вектор Т-світла перед секвенуванням (зверху). Мутація від C до G підтверджена картою Chromos (внизу). (C) Вставка 117 bp в кДНК p53 з клітин P6C, що призводить до передчасного зупинки кодону "TGA" після 25 амінокислот. (D) алелі p53 з пасажу 4 та пасажу 120 клітин P6C. CDNA була зворотно транскрибована з мРНК, а ген p53 ампліфікований за допомогою ПЛР перед вставкою в Т-вектор. Статистичний аналіз алелів p53 проводили шляхом секвенування від 10 до 22 конструкцій з кожної проби.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Генетична мутація генів супресорів пухлини, таких як p53, тісно пов'язана з ініціацією раку. Ми подумали, чи мають CSC мутований ген р53, що може бути пов’язано з їх аномальною проліферацією. Ген p53 клонували з клітинної лінії P6C, і аналіз послідовності показав, що мутанти від 72P до R мали місце у 60% та 67% клітин пасажу 4 та 120 клітин відповідно (Фігура 4B, 4D). Ми також виявили вставку 117 bp в кДНК p53; це введення призвело до обрізання 25 амінокислот на N-кінці p53 (Фігура 4C). Важливо, що ми виявили, що мутації гена p53 були подібними як у клітинах з низьким пасажем (пасаж 4), так і в клітинах з високим пасажем (пасаж 120), що наводить на думку, що ці мутації не накопичуються через умови культури клітин in vitro (рис. 4D). ). Ці дані також підтверджують можливість того, що мутації в деяких стовбурових клітинах можуть призвести до виникнення CSC, як уже пропонувалося.

Ми також визначили швидкість проліферації клітин Р6С в моношаровій культурі, обчисливши швидкість росту клітин. Як показано на додатковому малюнку 5, час подвоєння клітин Р6С становив

20 годин, подібно до клітинних ліній SW480 та HCT116 (P> 0,05). Ці дані свідчать про те, що клітини P6C мають подібні проліферативні властивості з диференційованими клітинними лініями раку прямої кишки при вирощуванні в посуді для культури клітин.

Голоконова ксенотрансплантатна пухлина, отримана з однієї клітини

Далі ми розглянули питання, чи не може одна клітина P6C призвести до пухлини ксенотрансплантата, що є відмінною рисою CSC. Оголеним мишам вводили одноклітинні голоклони, що містять приблизно 500 клітин. Дивно, але пухлини ксенотрансплантата почалися зі 100% частотою (6/6). Потім ми дисоціювали та трипсинували пухлини оголених мишей для регенерації окремих похідних клітин вторинних клонів. Повторне введення вторинних клонів, приблизно 500 клітин, оголеним мишам також призвело до 100% частоти ініціювання пухлини. Ці дані також підтверджують уявлення про те, що клітини P6C здатні до самовідновлення та диференціації in vivo .

Однією з переваг лінії CSC є забезпечення ідеальної системи для моніторингу прогресування пухлини in vivo. Для цієї стратегії ми попередньо позначили клітини P6C-OPG за допомогою DsRed та очистили подвійні позитивні клітини за допомогою FACS (рис. 5А). Подвійні позитивні голоклони DsRed/GFP були відібрані та трансплантовані оголеним мишам (малюнок 5B). Розвиток пухлини візуалізували за допомогою флуоресцентних зображень всього тіла, як показано на малюнку 5С. Імуногістохімія GFP показала, що деякі Oct6/4-позитивні клітини P6C диференціюються в Oct3/4-негативні клітини в пухлинах ксенотрансплантата. Колокалізація CD44 та Oct3/4 була виявлена ​​фарбуванням серійних зрізів. Цікаво, що подвійні позитивні клітини CD44 та Oct3/4 були розташовані в кластерах у пухлинах ксенотрансплантата, подібних до первинного раку (рис. 5D).

Зображення пухлин, отриманих з одного клону клітини P6C. (A) DsRed-мічені клітини P6C-OPG сортували за FACS. Клітини P6C-OPG трансфікували конструкцією DsRed і аналізували FACS. GFP/DsRed подвійні позитивні клітини відокремлювали для розмноження в культуральних посудах. (B) GFP/DsRed подвійні позитивні клони. DsRed стабільно експресувався в одній клітині, отриманій з клону P6C-OPG. Шкала, 200 мкм. (C) Ксенотрансплантатні пухлини, ініційовані міченими DsRed голоклонами P6C-OPG у оголених мишей. Пухлини були виявлені за допомогою флуоресцентної візуалізації всього тіла (in vivo FX PRO, Carestream) і показали відносну інтенсивність флуоресценції при d 0 і 30. (D) Імуногістохімія пухлин ксенотрансплантата. Пухлини фіксували в парафіні та CD44, а антитіла GFP використовували для виявлення експресії CD44 та Oct3/4. Шкала, 200 мкм.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Резистентність до ліків клітин Р6С

Існує припущення, що КСК здатні надавати стійкість до наркотиків та сприяти рецидиву раку. Тому ми намагалися вирішити питання, чи стійкі Р6С до хіміотерапевтичних засобів. Камптотецин (CPT) та 5-фторурацил (5-FU) є загальновживаними хіміотерапевтичними засобами при лікуванні колоректального раку. Порівняно з клітинами HCT116 та SW480, ми виявили, що клітини P6C були менш чутливими до CPT та 5-FU (рис. 6A, 6B; додатковий малюнок 6A). На додаток до відсутності інгібування клітинної проліферації, клітини P6C були високо стійкими до 5-FU-індукованого апоптозу, як показано фарбуванням у додаток V/PI (малюнок 6B, 6C; додатковий малюнок 6B). Оскільки найбільш часто використовувані хіміотерапевтичні засоби діють через зупинку клітинного циклу, ми дослідили, чи впливає 5-FU на клітинний цикл. На наш подив, клітини P6C були менш чутливими до індукованої 5-FU контрольної точки S-G2 порівняно з клітинами SW480 порівняно з клітинами SW480. Хоча зупинка клітинного циклу тривала протягом 48 годин, цей ефект послаблювався протягом 72 годин (рис. 6D). Ці дані свідчать про те, що в CSC існує унікальний контрольний пункт клітинного циклу, що призводить до лікарської стійкості.

Хеморезистентність клітин Р6С. (A) Морфологічне спостереження клітин P6C, HCT116 та SW480, оброблених 2 мкмоль/л камптотецину. Морфологію клітин спостерігали під мікроскопом через 24 і 48 годин. Шкала, 100 мкм. (B) 5-FU індукована загибель клітин P6C та SW480 клітин. Клітини обробляли 1 мкг/мл 5-FU протягом зазначеного часу, а потім трипсинізували. Після фарбування додатками V і PI проводили проточний цитометричний аналіз. (C) Статистичний аналіз індукованої 5-FU загибелі клітин. Клітини P6C та SW480 обробляли 0, 1, 1 та 10 мкг/мл 5-FU у зазначені терміни. Клітинна загибель розраховувалася як відсоток клітин PI +, визначений за допомогою проточної цитометрії. Цей експеримент повторювали тричі. c P 18, 19, 20. Попередній звіт також показав, що неправильна експресія гена OCT4 призвела до значної дисплазії кишечника 21. По-третє, ми продемонстрували, що намистини або голоклони, отримані з однієї клітини, призводили до 100% захворюваності на пухлину ксенотрансплантата у оголених мишей. Нарешті, що важливо, ми показали, що Р6С можуть піддаватися самообновлення та диференціації. Обидві функції мають вирішальне значення для прогресування CSC до пухлини.

Внесок автора

Гуан-хуа РАО проводив імунологічні аналізи та брав участь у створенні клітинної лінії за допомогою Сяо-хуй ВАНГ, Цзюнь ВАНГ та Хай-цзин ЦЗІН; Hong-min LIU проводив дослідження клітин, брав участь у культурі клітин та готував рукопис; Бао-Вей Л.І. та Ян-лей ЯН взяли зразки пухлини, провели дослідження пухлинності; Jia-jie HAO та Ming-rong WANG провели генетичні дослідження; Куан ЧЕН розробив експерименти та опрацював рукопис; і Lei DU проводили молекулярні дослідження та статистичний аналіз, брали участь у розробці експериментів та готували рукопис.

Додаткова інформація

Файли зображень

Додаткове зображення S1

Контроль анти-CD45, анти-CD31 та анти-CD24 антитіла.