Розмір тексту

Читач вмісту

5.1 ВИДИ ТА ВИБРАНІ

Поживні середовища в основному визначаються їх хімічними якостями, тобто складом; Вони також повинні визначатися своїми фізичними якостями, такими як стан, солоність тощо.

Більшість використовуваних засобів мають назву, дану тим, хто їх сформулював; Інші виникають внаслідок модифікацій загальних носіїв інформації, які є найбільш відомими. Серед перших можна відзначити:

Вибір культурального середовища здійснюється виходячи з попередніх наявних знань: виду, сорту, типу культури в пробірці, умови інкубації тощо, і в основному відповідатимуть за успіх або провал процесу. Зазвичай вибирається найбагатша середовище, яку дозволяє вид або сорт, оскільки ріст буде кращим.

5.2 ВИДИ СПОЛУК СЕРЕДНЬОГО

1. Мінеральні солі: макроелементи та мікроелементи

3. Регулятори росту

4. Джерело вуглецю

5. Інші органічні сполуки

6. Інші сполуки для специфічного використання

7. Желюючий засіб (якщо застосовується)

8. Добавки невизначеного складу

Функції цих сполук можуть бути поживними для розвитку рослин, але вони можуть мати і додаткові функції. Наприклад, Zn впливає на синтез ауксинів.

Мінеральні солі та, головним чином, макроелементи, окрім того, що кожна грає певну роль у живленні експлантату, відповідають за кінцеву соленість середовища, яка визначатиме більшу чи меншу здатність засвоєння поживних речовин залежно від типу. видів, що культивуються.

Посіви проводять певний фотосинтез, але їх живлення переважно гетеротрофне; Їм потрібні мінеральні сполуки, а також джерело вуглецю.

Гормонами, які потрібно вводити, є, як правило, ауксини та цитокініни, однак у міру збільшення часу посіву в пробірці і, виконуючи субкультури, експлантант набуває здатності синтезувати власні ауксини або цитокініни, більше не вимагаючи їх екзогенного внеску в середовище. Це явище відоме як звикання.

5.3. СКЛАД РОСТУЩИХ ЗМІ

• Ауксини: Індол-оцтова кислота (IAA), нафталін оцтова кислота (NAA), індол-масляна кислота (IBA), 2,4-дихлор-фенокси-оцтова кислота (2,4-D)

• Цитокініни: бензиладенин (BA), кінетин (KIN)

• Гібереліни: Гіберелінова кислота (GA3)

• Абсцизова кислота (ABA)

• Інші регулятори розвитку рослин

Серед них частим є додавання ауксинів та цитокінінів, у різних пропорціях, що залежить, головним чином, від типу диференціювання, що індукується, та типу видів, що культивуються. Використання інших регуляторів є набагато більш випадковим.

Вуглеводи:

• Моносахариди: глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, арабіноза, рибоза, ксилоза

• Дисахариди: сахароза, мальтоза, целобіоза, трегалоза, лактоза

• Трисахариди: рафіноза

• Полісахариди: крохмаль, целюлоза Серед них найпоширенішим у культуральних середовищах є сахароза.

Інші органічні сполуки:

• Амінокислоти

• Поліаміни Його використання різноманітне: для забезпечення додаткового джерела азоту у формі амінів, для отримання морфогенних процесів тощо. Добавки невизначеного складу:

• Витяги дріжджі, солод, м’ясо, овочі (картопля, кукурудза, коріння та кореневища)

• Фруктові або овочеві соки (апельсин, банан, ананас, помідор, картопля, кокосове молоко)

• Гідролізований казеїн Його використання недоцільно, оскільки не можна вказувати точний склад доданого екстракту, вони можуть бути корисними лише у конкретних випадках.

Специфічні сполуки:

• Антиоксиданти: лимонна кислота, аскорбінова кислота

• Адсорбенти: активоване вугілля

• Контролери осмотичного потенціалу: поліетиленгліколь, маніт. Його внесок у середовище можна уточнити за певних умов.

5.4. ЕФЕКТИ ВАРІАЦІЙ В ТИПАХ І КОНЦЕНТРАЦІЯХ

Внесок усіх сполук у живильне середовище повинен здійснюватись у більш-менш широкому діапазоні, залежно від конкретної сполуки та культури in vitro, яку потрібно проводити (види тощо). Як його дефіцит, так і надлишок спричиняють негативний вплив на ріст і розвиток рослини.

Щоб проілюструвати цей аспект, ми можемо розглянути вплив концентрації азоту на два сорти хризантеми: для обох існує оптимальний діапазон, хоча в одному варіації азоту впливають на ріст набагато більше, ніж в іншому. В ідеалі для кожної сполуки слід встановити відповідний діапазон для значної групи культур in vitro.

media

Кількість стебел адвентиціонів, що утворюються безпосередньо в експлантатах хризантеми, вирощених у середовищі РС із збільшенням концентрації азоту. (Рост і Бокельманн, 1975)

Що стосується джерела вуглецю, яке потрібно поставити, то найчастіше використовується сахароза, яка є звичайним цукром, та та, яку зазвичай використовують рослини. Його концентрація в живильному середовищі становить від 2 до 3%, і лише деякі спеціалізовані типи культури можуть вимагати більшої кількості. Його концентрація також має ефекти, подібні до тих, що спостерігаються при азоті.

Вплив збільшення концентрації сахарози на безпосереднє утворення адвентивних стебел у
з квітконосів двох сортів хризантеми. (Рост і Бокельманн, 1975)

Діапазон внеску рослинних гомонів визначити складніше, оскільки вони діють у дуже низьких концентраціях мікромолярного порядку, і ефект, який вони надають, не виробляється лише кожним конкретним гормоном, але в більшості випадків це відбувається. відносна кількість одних гормонів щодо іншого або інших. Крім того, його ефекти сильно залежать від типу культивованої рослини, типу розвитку, якого потрібно досягти, характеристик експлантату та системи вирощування. Гормонами, які зазвичай надходять до культуральних середовищ, є ауксини та цитокініни. Вплив їх розвитку на відносний масштаб ауксинів проти цитокінінів можна побачити на малюнку нижче. З іншого боку, взаємозв’язки між обома типами гормонів не є лінійними. Зовнішній вигляд цього показника буде змінюватися, якщо 2 конкретні гормони, що надаються, були іншим ауксином та іншим цитокініном.

Відносні концентрації ауксинів та цитокінінів, необхідні для росту та морфогенезу.

Відсоток каллуси люцерни, яка при інкубації в середовищах з різною концентрацією ауксинів та цитокунінінів утворює додаткові стебла (Сондерс і Бігем, 1975)

5.5 ФІЗИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗРОСТАННЯ ЗМІ

Формульовані культуральні середовища будуть рідкими, і для їх аерації потрібно використовувати контейнери з високою поверхнею, які перемішуються горизонтально зі швидкістю 100-200 об/хв. Поживні речовини однорідно розподіляються в середовищі і легко засвоюються, дозволяючи швидке зростання. Однак вирощування в рідкому середовищі створює проблеми для різних видів, переважно деревних.

Деякі альтернативи необхідності струшувати рідкі культуральні середовища - це культура "паперового містка" та "плаваючі мембрани", хоча жоден з них не був зручним для використання. Інший варіант - це двофазні середовища, в яких до культури в твердому середовищі додають тонкий шар рідкого середовища; нові сполуки рідкого середовища дифундують у тверде середовище, звідки експлант їх прийме, змінюючи схему їх розвитку, якщо вони відрізнялися від сполук вихідного твердого середовища; таким чином уникнути передачі експлантату культурального середовища для модифікації схеми його розвитку. У цій системі дифузія сполук між двома фазами не контролюється.

Іншою альтернативою рідким середовищам є так звані тверді або напівтверді середовища, в які додається неживна сполука, яка гелює середовище.

Гелеутворюючим агентом зазвичай є тверда речовина, яка при додаванні до культурального середовища розчиняється сильним нагріванням (близько 100 ºC) і змушує середовище набувати консистенцію гелю при охолодженні до більш низьких температур. Одним з найкращих желюючих агентів, доступних для культури рослинних тканин in vitro, є агар, також відомий як агар-агар. Желюючі агенти повинні відповідати ряду вимог: не засвоюватися експлантом, який змусить середовище повернутися до рідкої стадії при споживанні, не заважатиме засвоєнню поживних речовин із живильного середовища і залишатиметься стабільним з часом.

Агар - це природний, нерозгалужений полісахарид з високою молекулярною масою (3000-10000), що видобувається з червоних водоростей, родофіцеїв, головним чином із роду Gelidium. Він складається з галактозидів, що утворюють агарозу, та сульфатованого полісахариду - агаропектину. Крім того, він містить дуже малу кількість катіонів у вигляді домішок (Na, K, Ca, Mg тощо). Склад його дещо варіюється в залежності від виду, з якого його видобувають, його походження, часу збору, стиглості водорості тощо. Процеси отримання та очищення для отримання різних видів агару в основному впливають на вміст їх домішок.

Основною характеристикою, що робить агар желюючим агентом, є його повне розчинення у воді при нагріванні до 85-100 ºC та його гелеутворення при температурі близько 35 ºC. Він є термореверсивним, тобто його можна багаторазово повторно розчиняти і желювати внаслідок коливань температури, і він піддається автоклавуванню. Його гелеутворення залежить від рН живильного середовища і є оптимальним для рН 5,4-5,7. Поживні середовища для рослинних тканин зазвичай доводять до рН = 5,7 перед додаванням агару, щоб вони добре плавились; після гелеутворення агар поглинає кількість води, що до 200-300 разів перевищує її вагу, і утворює дуже напівпрозорий гель. Приготування культуральних середовищ для овочів, як правило, включає вміст агару 0,8%.

Детальну інформацію про типи агару можна знайти в різних комерційних марках, наприклад, у цьому pdf

Серед альтернативних агару сполук, що використовуються як желюючі речовини в культурі рослинних тканин in vitro, ми маємо:

• Альгінати. Відмінно підходить для суспензії клітин та культури протопластів.

• Агароза. Це один з полімерів агару, який отримують з нього. Він використовується більше в електрофорезі білків або нуклеїнових кислот, ніж у культурі in vitro.

• Фітагель. Також відомий під назвою гельрит, зареєстрована торгова марка Merck; він широко використовується.

• Фікол. Це похідне полісахариду, яке утворює середовище живлення колоїдного типу. Знаходить важливе застосування в культурі пиляків.

Фітагель - це аніонний полісахарид, отриманий шляхом бактеріального бродіння. Гель, який утворюється, в основному характеризується:

• Велика прозорість, що полегшує моніторинг врожаю.

• Гелі живильного середовища із вмістом фітагелю лише 0,2%

• Для його гелеутворення потрібні двовалентні катіони, головним чином Mg або Ca.

• Розчиняється і гелюється у відповідь на зміну температури, як агар, хоча він не термообертається.

• Експланти, вирощені в середовищах з фітагелем, дуже легко поглинають поживні речовини, що дозволяє пришвидшити ріст, однак швидкість поглинання може бути надмірною, і вони не можуть бути включені в їх структуру та сполуки, але залишаться в розчині в експлантаті, що спричиняє проблему типово відомий як гіпергідричність, поширений у деревних культурах.

• Його вартість набагато нижча

Культурні експланти в пробірці вони будуть поглинати сполуки разом із водою із середовища, яке вони поглинають, за умови, що водний потенціал експлантату є більш негативним, ніж осмотичний потенціал середовища. Осмотичний потенціал залежить від сполук середовища, головним чином найпоширеніших: джерела вуглецю, макроелементів (головним чином N і K) та желюючого агента, де це доречно.

Внесок джерела вуглецю в осмотичний потенціал залежить від його концентрації. Желюючий агент має відносно стабільний внесок в осмотичний потенціал, навряд чи впливає його тип або концентрація, яка майже не коливається. Макроелементи в культуральних середовищах також важливі з точки зору їх повного осмотичного потенціалу.