ТЕХНІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ РОЗВИТКУ ПІСЛІМНОЇ СИСТЕМИ Дипломна робота До здобуття ступеня магістра СТІЙКИХ СИСТЕМ ВИРОБНИЦТВА, ІММУНОГЛОБУЛІНІВ ТА ЯК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБІООТЕРАПІЇ ПРОТИ Escherichia coli: Педагог Вільям Білро Пабло Седеньо Рейес Гуаякіль 23 квітня 2015 р. I

тіхнічний

СЕРТИФІКАЦІЯ ПІСЛЯ ДИСЦІПЛІЙНОЇ СИСТЕМИ Ми підтверджуємо, що ця робота була проведена в повному обсязі магістром Педро Пабло Седено Рейесом як часткова вимога для здобуття наукового ступеня магістра в галузі стійких систем тваринництва. Гуаякіль, квітень 2015 р. ДИРЕКТОР Д-Р Д-р Вільям Лопес Васкес. РЕЦЕНЗЕНТИ: Інж. Ноелія Кайседо Коелло. Доктор Хосе Альварес Альварадо ДИРЕКТОР ПРОГРАМИ Інж. Джон Е. Франко Родрігес. ii

ДЕКЛАРАЦІЯ ВІДПОВІДАЛЬНОСТІ Педро Пабло Седеньо Рейес ЗАЯВЛЯЄТЬ, ЩО: Дипломний проект під назвою ІММУНОГЛОБУЛІНИ І, ЯК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБІОТЕРАПІЇ ПРОТИ Escherichia coli В СИСТЕМАХ ВИРОБНИЦТВА КУРЯЧИХ БРОЙЛЕРІВ, розроблений на основі інтелектуальних прав, розроблених на основі інтелектуального права цитати, що містяться на кожній відповідній сторінці, джерела яких включені в бібліографію. Отже, ця робота є моєю власною. У силу цього твердження я відповідаю за зміст, правдивість та науковий обсяг відповідного дипломного проекту. Гуаякіль, квітень 2015 р. АВТОР Педро Пабло Седено Рейєс С.І. 1308992104 iii

АВТОРИЗАЦІЯ ПІСЛЯ ДИСЦІПЕНЦІЙНОЇ СИСТЕМИ I, Педро Пабло Седеньо Рейес, уповноважує Університет Католіки Сантьяго де Гуаякіль, публікацію в бібліотеці Установи проекту під назвою: Імуноглобуліни Y, як альтернатива антибіотикотерапії проти кишкової палички в системах виробництва бройлерних курей., чий зміст, ідеї та критерії є моєю єдиною відповідальністю та авторством. Гуаякіль, квітень 2015 р. АВТОР Педро Пабло Седено Рейєс С.І. 1308992104 iv

ДЯКУЄМО Католицькому університету Сантьяго де Гуаякіля. До Llaguno Cía. Ltda., За те, що дозволив мені провести цю дослідницьку роботу в галузі тваринництва та щодо властивостей, якими вони володіють. Доктору Гонсало Ллагуно Фігероа, який завжди підтримував мене в ході цього розслідування. До Q.F. Сорая Тапіа Бастідас, керівник виробництва в Laboratorios Llaguno. До доктора Педро Сакото. Керівник виробництва Laboratorios Llaguno. Інженеру Маркосу Ольгіну Бургосу. Начальник відділу технічного обслуговування. Доктору Анібалу Робаліно Робайо. Вчитель і друг. Доктору Мауро Лоуру Макіасу. Вчитель і друг. Нашим професорам з любов’ю, повагою та захопленням. v

ІНДЕКС РОЗДІЛ ЗМІСТ СТОРІНКА. 1. ПІДХІД. 1 1.1. ФОН. 1 1.2. Опис об'єкта розслідування. 3 1.3. Обґрунтування. 4 1.4. Питання дослідження. 6 1.5. Цілі. 7 1.5.1. Загальні. 7 1.5.2. Конкретні . 7 2. ТЕОРЕТИЧНА КАДР. 8 2.1. Колібактеріоз. 8 2.1.1. Захворюваність та розподіл. 9 2.1.2. Етіологія та патогенез. 10 2.1.3. Клінічні дані та ураження . 14 2.1.4. Діагностика. 15 2.1.5. Зооноз. 17 2.1.6. Лікування. 20 2.1.7. Профілактика. 21 2.2. Антимікробна стійкість бактерій 22 2.3. Альтернативні методи лікування кишкових інфекційних проблем . 25 2.3.1. Ефірна олія рослини материнки. 25 2.3.2. Застосування імуномодуляторів 26 2.3.3. Пребіотики та пробіотики . 27 2.3.4. Фітогенні харчові добавки (PFA). 28 2.3.5 Органічні кислоти 28 2.3.6. Застосування імуноглобулінів Y. 29 2.4. Імуноглобулін Y, з яєчного жовтка. 30 vi

2.4.1. Специфічність IgY. 33 2.4.2. Перенесення IgY в яйцеклітину 34 2.4.3. Вилучення та виділення IgY з яєчного жовтка. 35 2.4.4. Використання та переваги IgY . 36 2.4.5. Застосування імуноглобулінів Y у діагностичних імуносерологічних тестах 38 2.5. Титрування вірусів або бактерій 39 2.5.1. Кваліфікація. 39 2.5.2. Типи ступеня. 40 2.6. Застосування вакцин. 43 2.7. Медіа культури . 43 2.7.1. Класифікація культурних середовищ. 44 2.7.1.1. Культуральні середовища відповідно до їх консистенції 44 2.7.1.2. Культурні середовища відповідно до їх призначення . 45 2.7.2. Комерційні засоби масової інформації. 46 2.7.2.1. Поживне середовище L.B. (Лурія Бертані) або Агар Міллер. 46 2.7.2.2. Поживне середовище триптичного соєвого бульйону (TSB). 47 2.7.2.3. Агар MacConkey середній 48 2.7.3. Підготовка культурних середовищ . 49 2.7.3.1. Приготування розчину 49 2.7.3.2. Стерилізація 50 2.7.3.3. Пластина розлита . 50 3. МЕТОДОЛОГІЯ. 51 3.1. Фокус 51 3.2. Всесвіт. 52 3.3. Місце проведення досліджень . 53 3.4. Обладнання та матеріали. 54 3.4.1. Лабораторні матеріали 54 3.4.2. Польові матеріали 55 3.5. Змінні, що вивчаються. 56 vii

3.5.1. Змінні або категорії дослідження 56 3.5.2. Вимірювання змінних. 56 3.5.2.1. Хворобливість 56 3.5.2.2. Смертність. 57 3.5.2.3. Вартість лікування 57 3.6. Методи . 57 Опис роботи . 57 3.6.1. Виділення та секвенування E. coli . 58 3.6.2. Титрування бактерій E. coli 58 3.6.2.1. Підготовка культуральних середовищ 58 3.6.2.2. Посів кишкової палички та інкубація протягом 18 годин 60 3.6.2.3. Перше розведення кишкової палички (розведення 1 на 10) та інкубація протягом 18 годин. 60 3.6.2.4. Друге розведення кишкової палички (розведення 1 на 100) та інкубація протягом 4 годин. 61 3.6.2.5. Інокуляція кишкової палички у твердому середовищі та у одноденних курчат 61 3.6.2.6. Період спостереження. 61 3.6.2.7. Протистояння імуноглобулінів з уже титрованими бактеріями. 62 3.6.2.8. Процедури збору даних. 63 3.6.3. Статистичні дослідження 65 3.6.4. План роботи. 66 4. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ. 67 5. ВИСНОВКИ. 76 6. РЕКОМЕНДАЦІЇ . 77 БІБЛІОГРАФІЯ. 78 ДОДАТКИ. 89 viii

ІНДЕКС ТАБЛИЦ ЗМІСТ СТОРІНКА. Таблиця 1 Ефективність імуноглобуліну Y проти зараження 1 LD 50% E. coli та порівняння коефіцієнта перетворення їжі (FC) на 7 день після щеплення. 35 днів . 68 Таблиця 2 Порівняння коефіцієнта перетворення корму (ФК) на 13 день після щеплення. 41 день . 70 Таблиця 3 Безпека імуноглобулінів, що застосовуються до курей Ross 308. 72 Таблиця 4 Порівняння витрат на лікування. 73 ix

ІНДЕКС ГРАФІКИ ЗМІСТ СТОРІНКА. Графік 1 Ефективність обробок щодо накопиченого ФК. 71 х

ІНДЕКС ФІГУР Рисунок 1 Рисунок 2 Розташування кантону Ломас-де-Саргентілло, провінція Гуаяс. 89 Посів E coli у рідке середовище (TSB) 89 Рисунок 3 Розведення E Coli для отримання LD50. 90 Рисунок 4 Колонії кишкової палички на агарі МакКонкі. 90 Рисунок 5 Рисунок 6 Рисунок 7 Інокуляція E. coli у 1-денних курчат для отримання LD 50. 91 Група курчат, інокульованих E coli при розведенні 10-10. 91 Збір даних для визначення летальності E Coli у одноденних курчат 92 Рисунок 8 Застосування IgY безпосередньо до поїлки. 92 Рисунок 9 Застосування E Coli. 93 Рисунок 10 Спеціальний шприц, що використовується для щеплення E coli 93 xi

виробляти, мінімізуючи кількість хімічних речовин усіх видів, що використовуються у птахівництві. Зниження виробничих витрат у птахівництві буде більшим, якщо зменшити споживання антибіотиків, оскільки великий імпорт цієї сировини зменшиться, що призведе до збільшення прибутку, збільшення активності птиці та водночас поліпшення інфраструктури птахівництва Еквадору. 5

1.4. Запитання для досліджень Чи може IgY бути корисним для контролю ефекту E.coli у птахівництві? Чи буде безпечним використання IgY в інтенсивних системах виробництва курчат-бройлерів? птахів? IgY може бути альтернативою імунотерапії 6

1.5. ЗАВДАННЯ 1.5.1. Загальне Для оцінки використання імуноглобулінів у контролі агента E. coli, який впливає на системи виробництва курчат-бройлерів. 1.5.2. Конкретний 1. Визначити ефективність імуноглобулінів проти кишкової палички у курчат-бройлерів. 2. Проаналізуйте безпеку використання імуноглобулінів у системах інтенсивного виробництва курчат-бройлерів. 3. Проведіть аналіз витрат на лікування імуноглобулінами порівняно з лікуванням антибіотиками. 7

вірулентні, що спричинили важливі наслідки для здоров’я жителів цих країн (EFSA, 2014). 2.1.6. Лікування Відповідно до Stanchi (2007), умови господарювання та умови навколишнього середовища, яким піддаються постраждалі тварини, роблять їх більш сприйнятливими до кишкової палички, невибіркове вживання наркотиків спричинило розвиток стійкості. Серед антимікробних препаратів, що виявляють активність щодо цих мікроорганізмів, є комбінація Сульфаметоксазол + триметопін, Гентаміцин та Левоміцетин. Паес та Окампо (2005) вказують, що лікування кишкової палички є: a. Лікування харчовими продуктами Фуразолідон 400 проміле протягом 5 днів як лікувальний засіб. Оксолінова кислота при 150 ppm протягом 5-7 днів. Хлортетрациклін 400 ppm протягом 5-7 днів як лікувальний засіб. Окситетрациклін 400 ppm протягом 5 - 7 днів як лікувальний засіб. Амоксицилін 192 ppm протягом 5 днів як лікувальний засіб. Сульфадиметоксин 120 ppm + триметоприн 30 ppm протягом 5 - 7 днів як лікувальний засіб. Сульфахлоропіридазин 150-300 ppm + Триметоприн 30-60 ppm протягом 7 днів як лікувальний засіб. Фосфоміцин у дозах від 10 до 40 мг/кг. Еритроміцин 200 ppm + Colistin 20 ppm протягом 5 - 8 днів як лікувальний засіб. двадцять

За даними Переза ​​(2009), біозидна або біостатична дія органічних кислот відбувається двома різними шляхами: вони втручаються в метаболізм вуглеводів у клітинній стінці мікроорганізмів, де різні ферменти блокуються, так що вони є клітинами, гинуть. Мікроорганізми краще розмножуються при рН, близькому до нейтрального, тому, підкислюючи їжу додаванням органічних кислот, можна обмежити ріст бактерій. 2.3.6. Застосування імуноглобулінів Y У різних населених пунктах нашої планети проводились численні дослідницькі роботи, щоб підтвердити переваги імуноглобулінів для здоров'я домашніх тварин, ці роботи проводились експериментально в лабораторіях та за нормальних умов поводження з молочними конюшнями. форми: У роботі, проведеній у сараї, вводили IgY двох а) Молочних замінників, до яких додавали частину порошкового яєчного жовтка, що надходив від гіперімунізованих курей. б) Безпосереднє введення цілого яйця, джерело не вказує, зшите воно чи сире. 29

- Імуноблот. Вторинні тести. - Опади. - Аглютинація. - Фіксація комплементу. Третинні тести. - реакція нейтралізації. - Захист. 2.5. Титрування вірусів чи бактерій Титрування вірусів та бактерій та метод Рід та Мюнча, цитоване Лопесом (2010). Титрування вірусу використовується для визначення кількості вірусу в суспензії. Для титрування вірусу проводяться розведення, щоб визначити найбільше розведення, яке дає бажаний ефект, наприклад: я хочу знати, до якого розведення вірус вбиває, паралізує, виробляє цитопатичний ефект, серед інших 2.5.1. Титрування Етапи проведення титрування: Зробіть розведення: найбільш використовуваними є: Розведення в основі 2. У кілька пробірок (вони повинні бути пронумеровані) помістіть 1 мл розчинника (сольовий розчин). Пізніше потрібно 39

1 мл вірусу від зразка матері та додайте його в пробірку № 1 (розведення 1: 2). Потім з першої пробірки відбирають 1 мл і додають до другої пробірки (розведення 1: 4) і так далі проводять розведення. Тому врешті-решт ми завжди матимемо 1 мл обсягу в кожній пробірці, і це буде відрізнятися від розведення. 1 мл розведення AAAA в основі 10. У декілька пробірок (пронумерованих) поміщають 9 мл розчинника (сольовий розчин), потім 1 мл вірусу відбирають з деякої матері-зразка і поміщають у пробірку № 1 (розведення 1: 10) . Потім з першої пробірки беруть 1 мл і додають до другої пробірки (розведення 1: 100), і так далі роблять розведення. (1/10 = 10-1; 1/100 = 10-2; 1/1000 = 10-3; 1/10000 = 10-4). 2.5.2. Типи титрування Титрування вірусом використовується для визначення кількості вірусу в суспензії. 100% інфекційна назва. У цьому біологічному кількісному визначенні кінцева точка зазвичай розглядається як максимальне розведення, яке виробляє цей ефект. Кінцеву точку 100% можна оцінити при максимальному розведенні, яке дає очікуваний ефект у 100% інокулятів, це не дуже точно і рідко використовується. 40

50% інфекційний титул. У більшості лабораторій використовується кінцева точка 50%, яка буде максимальним розведенням, що впливає щонайменше на 50% інокулятів. Це також виражається як 50% летальна доза (LD50) або 50% інфекційна доза (ID50). Найкращий спосіб визначити цю кінцеву точку - це використання великої кількості тварин і близьких розведень. Роблять серію розведень мікроорганізму (або сироватку, якщо сироватку потрібно титрувати, щоб дізнатись рівень антитіл), і кожне розведення інокулюють у невелику групу біологічного субстрату, який буде використовуватися (клітини, вирощені в пробірках, мікропланшетах, ембріоновані яйця, миші та інші), як правило, від 6 до 8 одиниць на розведення. Рід та Муенч у 1938 р., Цитовані Лопесом (2005), розробили метод для оцінки кінцевої точки 50% заражених доз, які використовуються у всіх лабораторіях. Як приклад пропонується наступна вправа: Здійснюють розведення базових 10, як правило, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10 -9, серед інших. Для інокуляції вибирають чотири або п’ять розведень, використовуючи, наприклад, 6 мишей на розведення. Припускаючи, що миші гинуть наступним чином: 10-3 6 щеплених і 6 загиблих 10-4 6 щеплених і 6 мертвих 10-5 6 щеплених і 4 мертвих 10-6 6 щеплених і 1 мертвих 10-7 6 щеплених і 0 мертвих 41

Впорядкування даних про смертність даних про смертність мертвих живих мертвих Частка% 10-3 6/6 6 0 17 0 17/17 100 10-4 6/6 6 0 11 0 11/11 100 10-5 4/6 4 2 5 2 5/7 71 10-6 1/6 1 5 1 7 1/8 13 10-7 0/6 0 6 0 13 0/13 0 Стовпець підсумовування смертей формується додаванням знизу вгору, оскільки на нижньому розбавлення буде вищою смертністю, і стовпець підсумовування живих буде здійснюватися шляхом додавання зверху вниз, оскільки чим більшим буде розведення, тим більшою буде кількість живих. Для визначення титру розбавлення, яке показує відсоток смертності відразу вище 50%, береться за основу, у цьому прикладі воно буде 10-5. 50% буде між цим розведенням і наступним, а пропорційне досягнення 50% обчислюється за такою формулою: (% негайної смертності> 50%) (50) (% негайної смертності> 50%) (% негайної смертності