УНІВЕРСИТЕТ ГРАНАДИ. ШКОЛА МЕДИЦИНИ. КАФЕДРА ФІЗІОЛОГІЇ ДОКТОРСЬКОГО ТЕЗУ ЧУТЛИВОСТІ СОЛІ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ГІПЕРТИРОЇДИЗМІ ТА ФУНКЦІЇ ТА ВИРАЖЕННІ ТРАНСПОРТЕРІВ НАТРІЮ ЩУРІВ З ДИСФУНКЦІЄЮ ЩИТИ РОСО ПЕРЕЗ АБД Гранада, 2012
Редактор: Редакція Університету Гранади Автор: Росіо Перес Абуд Д.Л .: GR 2331-2012 ISBN: 978-84-9028-105-5
ЖОЗЕ ФЕЛІКС ВАРГАС ПАЛОМАРЕС, КАТЕДРАТ ФІЗІОЛОГІЧНОГО КАФЕДРИ УНІВЕРСИТЕТУ ГРАНАДА. Це засвідчує: що робота, проведена під час підготовки докторської дисертації під назвою: Чутливість до солі при експериментальному гіпертиреозі та функція та експресія транспортерів натрію у щурів з дисфункцією щитовидної залози, представлена Росіо Пересом Абудом, була проведена під моїм керівництвом та напряму, що відповідає академічним умовам, необхідним для їх презентації, щоб здобути ступінь доктора. І для запису там, де це можливо, я підписую це в Гранаді, 26 січня 2012 р. Підписано. Хосе Фелікс Варгас Паломарес
АНТОНІО ОСУНА ОРТЕГА, КЕРІВНИК НЕФРОЛОГІЧНОЇ СЛУЖБИ УНІВЕРСИТЕТНОЇ ЛІКАРНІ ДІВИ ДЕ ЛАС НЕВЕС Це засвідчує: що робота, проведена під час підготовки докторської дисертації під назвою: Чутливість до солі при експериментальному гіпертиреозі та функція та експресія транспортерів натрію у щурів з дисфункцією щитовидної залози, представлена Росіо Пересом Абудом, була проведена під моїм керівництвом та напряму, що відповідає академічним умовам, необхідним для їх презентації, щоб здобути ступінь доктора. І для запису там, де це можливо, я підписую це в Гранаді, 26 січня 2012 р. Підписано. Антоніо Осуна Ортега
ЮАН МАНУЕЛ МОРЕНО АЮСО, ПРОФЕСОР КАФЕДРИ ФІЗІОЛОГІЇ УНІВЕРСИТЕТУ МУРЧІЯ Свідоцтво: Робота, проведена при підготовці докторської дисертації під назвою: Чутливість до солі при експериментальному гіпертиреозі та функція та експресія транспортерів натрію у щурів з дисфункцією щитовидної залози, представлені Росіо Пересом Абудом, виконувались під моїм керівництвом та керівництвом, відповідаючи академічним умовам, необхідним для їх презентації, щоб здобути ступінь доктора. І для запису там, де це можливо, я підписую це в Гранаді, 26 січня 2012 р. Підписано. Хуан Мануель Морено Аюсо
Результати цієї докторської дисертації опубліковані в: Pérez-Abúd R, Rodríguez-Gómez I, Villarejo AB, Moreno JM, Wangensteen R, Tassi M, O'Valle F, Osuna A, Vargas F. у щурів. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011 серпня; 301 (2): E281-7. Epub 2011, 26 квітня. Морено Дж. М., Перес-Абуд Р., Вангенстін Р., Родрігес Гомес І, Лопес Меріно І, Осуна А, Варгас Ф. Функція та експресія ниркових епітеліальних транспортерів натрію у щурів із порушенням функції щитовидної залози. J Ендокринол Інвест. 2011 8 листопада.
Моїм батькам, Мартіну та Лурду
Зміст I. ВСТУП. 1 1. БІОЛОГІЧНІ ЗМІННІ В ГІПІ ТА ГІПЕРТИРОЇДИЗМІ. СЕРЦЕВО-СУДИННІ ТА РЕНАЛЬНІ ПРОЯВИ. 3 1.1. Серцево-судинна функція 3 1.1.1. Гемодинамічні зміни. 3 1.1.2. Гіпертрофія серця. 4 1.2. Функція нирок. 7 1.2.1. Ниркова маса та лікування нирків натрієм. 7 1.2.2. Нирковий кровотік і швидкість клубочкової фільтрації. 9 1.2.3. Протеїнурія 10 1.3. Оксидативний стрес при гіпертиреозі. 11 1.4. Оксид азоту при дисфункції щитовидної залози. 12 1.4.1 Синтаза оксиду азоту. 12 1.4.2. Ефекти блокування NOS при гіпертиреозі. 14 2. ГІПЕРТЕНЗІЯ ПІД ЧУТЛИВІСТЬ СОЛІ. 17 2.1. Загальні положення. 17 2.2. Сіль і оксид азоту. 20 2.3. Сіль і окислювальний стрес. 23 2.4. Сіль і запалення. 26 2.4.1. Тубуло-інтерстиціальне запалення та гіпертонія. 26 2.4.2. Окислювальний стрес та активація факторів запалення. 27 2.4.3. Вживання солі та трансформуючий фактор росту або TGF-β1. 28 I
Покажчик 3. ТРАНСПОРТУВАННЯ НАТРІЮ ВЗАД НЕФРОН. 29 3.1. Регулювання реабсорбції NaCl та води. 34 3.2. Транспорт натрію в особливих ситуаціях. 36 3.2.1. Печінковий цироз. 36 3.2.2. Вагітність. 37 3.2.3. Гіпертонія через чутливість до солі. 38 3.2.4 Дефіцит гормонів щитовидної залози. 39 3.2.5. Гіпертиреоз 42 II. ПІДХОДИ ТА ЦІЛІ. 45 III. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ. 51 1. Використовувані наркотики та інструменти. 53 1.1. Наркотики. 53 1.2. Інструменти. 54 2. Експеримент 1. Чутливість до солі при експериментальному гіпертиреозі. 55 2.1. Тварини та розподіл. 55 2.1.1 Експериментальний протокол. 56 2.1.2 Визначення систолічного тиску методом хвостової плетизмографії. 57 2.1.3 Катетеризація стегнової артерії. 58 2.2. Аналітичні процедури. 58 2.2.1. Визначення протеїнурії. 58 2.2.2. Визначення амінопептидаз. 59 2.2.3. Визначення цитокінів. 60 2.2.3. Гістопатологічне дослідження. 60 Морфометричне дослідження. 60 II
Індекс 3. Експеримент 2. Функція та експресія транспортерів натрію у щурів з дисфункцією щитовидної залози. 61 3.1. Тварини та розподіл. 61 3.1.1. Експериментальний протокол. 62 3.2. Аналітичні процедури. 63 3.2.1. Підготовка тканин до вестерн-блот. 63 3.2.2. Електрофорез та вестерн-плями мембранних білків. 64 3.2.3. Отримання загальної РНК. 65 3.2.4. Зворотна транскрипція та ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу (RT-PCR). 65 4. Статистичний аналіз. 66 IV РЕЗУЛЬТАТИ. 69 1. Експеримент 1. Чутливість до солі при експериментальному гіпертиреозі. 71 1.1. Артеріальний тиск і частота серцевих скорочень. 71 1.2. Морфологічні змінні. 72 1.3. Змінні плазми та рівень гормонів щитовидної залози. 73 1.4. Сечові та метаболічні змінні. 75 1.5. Виведення нітритів і нітратів. 77 1.6. Змінні оксидативного стресу. 78 1.7. Сечові амінопептидази. 79 1.8. Морфометричні результати. 81 1.9. Змінні запалення в корі нирок. 81 2. Експеримент 2. Роль та експресія ниркових транспортерів натрію при дисфункції щитовидної залози. 82 2.1 Біологічні змінні. 82 III
Індекс 2.2. Реакція сечі на гіпертонічне та ізотонічне внутрішньочеревне перевантаження сольовим розчином у свідомих щурів з гіпо- та гіпертиреозом. 83 2.3. Реакція нирок на ацетазоламід у свідомих щурів та концентрація білка та експресія мРНК NHE3. 85 2.4. Ниркова реакція на фуросемід у свідомих щурів та концентрація білка та експресія мРНК NKCC2. 86 2.5 Реакція нирок на гідрохлоротіазид у щурів, що перебувають у свідомості, та концентрація білка та експресія мРНК TSC. 87 2.6. Ниркова реакція на амілорид у свідомих щурів та кількість білка та експресія мРНК αenac. 89 V. ОБГОВОРЕННЯ. 91 VI. ВИСНОВКИ. 113 VII. БІБЛІОГРАФІЯ. 117 IV
Введення гіпертрофії серця при гіпертиреозі. На підтвердження цієї пропозиції дослідження, проведені на культурах кардіоміоцитів, показали, що гормон щитовидної залози безпосередньо контролює експресію генів та фактори росту (Morgan and Baker, 1991). Таблиця 1. Гемодинамічні змінні при експериментальному гіпер- та гіпотиреозі Групи Гіпертиреоз Гіпотиреоз Морфологічні змінні Вага тіла Вага щитовидної залози Вага шлуночків Вага нирок Шлуночковий вага/вага тіла Вага нирок/маса тіла Лівий шлуночок/шлуночок Правий гемодинамічний змінний Кров'яний тиск Об'єм крові Серцевий викид Загальний периферичний опір Серце Частота пульсового тиску 2. Ниркова функція 1.2.1 Ниркова маса та ниркова терапія натрієм. Є дані про те, що гіпотиреоз зменшується, а гіпертиреоз збільшує масу нирок відносно маси тіла. Цей механізм не повністю зрозумілий, але, схоже, залучена SRA. Порушення роботи щитовидної залози мають важливий вплив на функцію нирок та метаболізм гідросаліну (Michael et al., 1972; Bradley et al., 1974; Emmanuel et al., 1974). Гіпотиреоз, викликаний тиреоїдектомією або хімічними методами, породжує 7
Вступ про те, що кілька досліджень, що описують помірне підвищення артеріального тиску при великому споживанні солі у щурів Спраг-Доулі (Wang et al., 1996; Ni and Vaziri, 2001; Newaz et al., 2005), сіль також збільшує частоту серцевих скорочень, пульсовий тиск, ізопростани сечі, метаболіти NO сечі (NOx), вазопресин, ендотелін та протеїнурія. Однак інші дослідження не виявили значних змін артеріального тиску у щурів Спраг-Доулі з великим споживанням солі (Debinski et al, 1990; Osborn and Hornfeldt, 1998). Ці розбіжності можуть відображати різницю в тривалості лікування або способі введення (в їжі або питній воді). Таблиця 2. Дослідження, проведені на щурах різними авторами, з дієтами, багатими сіллю, кормами або питною водою АВТОР (SAL) RATA P.A. МЕТОД T Banday (2007) Sankaralingam (2006) Gu (2006) Kobori (2003) Lenda (2000) Osborn (1998) 1% води SD - Прямий 12 днів 0,9% води SD Непрямий 3 тижні 4% Dhal-SS Непрямий 5 тиждень 8 % Dhal-SS Непрямий 4 тижні 7% SD - Прямий 3-4 тижні 4% SD Прямий 5-7 тижнів 19
Введення артеріального тиску за рахунок зменшення загального периферичного опору та збільшення виведення з сечею NaCl та води. Крім того, PNA та PNB також зменшують секрецію ADH із заднього гіпофіза (Berne and Levy, 2009). Малюнок 1: Транспортери вздовж нефрону Урогуанілін та гуанілін виробляються нейроендокринними клітинами в кишечнику у відповідь на пероральний прийом NaCl. Ці гормони потрапляють у циркуляцію та інгібують реабсорбцію NaCl та води нирками через активацію мембранно-зв’язаних рецепторів гуанілілциклази, що збільшують внутрішньоклітинний (цГМФ). Катехоламіни стимулюють реабсорбцію NaCl у всіх чотирьох сегментах нефрону. Хоча симпатичні нерви не активуються, коли обсяг LEC становить 35
II. ПІДХОДИ ТА ЦІЛІ
Підходи та цілі З огляду на це, цілями даної роботи є: вивчити можливу модулюючу роль гормонів щитовидної залози на чутливість до солі у щурів, проаналізувавши відповідь ПС, морфологічних змінних, функції нирок та окисного стресу при гіпер-гіпотиреозі з підвищеним споживання солі. Визначити вплив гіпер- та гіпотиреозу на функцію найважливіших ниркових транспортерів натрію (NHE3, NKCC2, NCC та ENaC) та їх кореляцію з експресією та кількістю цих білків. 49
III. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Матеріали та методи 1. Використовувані лікарські засоби та прилади 1.1 Препарати Ацетазоламід Соляна кислота Трис Аланіл-β-нафтиламід Бичачий сироватковий альбумін Амілорид Козине анти-кроляче кон'юговане вторинне антитіло Кроличі поліклональні антитіла ефір Формальдегід Фуросемід Глутаміл-β-нафтиламід Гідрохлортіазид Інгібітор протеази Ізопропіловий спирт Метимазол NaCl NaOH 53
Матеріали та методи Oligos PBS (Sigma) Пентобарбітал натрію Ізотонічний сольовий розчин TRIzol розчин Сахароза Гепаринізований сольовий розчин Ацетатний буфер Трьосновний сольовий буфер Тироксин (Merck) 1.2. Інструменти Immunolite 2000 Autoanalyzer Balance (Sartorius, Pacisa). Центрифуга (Григель). Морозильна камера -80Cº Спектрофотометр. Піч (Selecta). 000 шовних ниток Окремі метаболічні клітини (Tecniplast Gazzada, COD). Лабораторне обладнання плетизмографа (Letica). Політрон 54