novo

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • Клінічне секвенування екзоми
  • Культура клітин та трансфекція
  • Вилучення РНК та синтез кДНК
  • Розпад, опосередкований нісенітницею
  • Кількісна RT-PCR
  • Конструкції експресії ДНК та сайт-спрямований мутагенез
  • SDS-PAGE та вестерн-блот
  • Флуоресцентна мікроскопія
  • Аналізи репортерів люциферази
  • Біолюмінесцентний резонансний перенос енергії (BRET)
  • Статистичне значення
  • результат
  • Клінічний фенотип
  • Новий варіант послідовності FOXP1, ідентифікований секвенуванням екзоми
  • Функціональна характеристика варіанту послідовності FOXP1 в клітинах людини
  • обговорення
  • прирости
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Додатковий малюнок 2

предметів

  • Функціональна геноміка
  • Генетика нервової системи
  • Порушення неврологічного розвитку
  • Секвенування нового покоління

реферат

FOXP1 (білок Р1 передньої коробки) - це фактор транскрипції, який бере участь у розвитку кількох тканин, включаючи мозок. Виникаючий фенотип пацієнтів із варіантами FOXP1, що порушують білок, включає загальну затримку розвитку, розумову відсталість та легкий до серйозний дефіцит мови/мови. Мова йде про дитину з історією важкої гіпотонії, розладу аутистичного спектра та легкої психічної вади з важкими порушеннями мови/мови. Клінічне секвенування екзоми виявило гетерозиготний de novo варіант FOXP1 c.1267_1268delGT (p.V423Hfs * 37). Функціональний аналіз із використанням клітинних моделей вказує на те, що варіант порушує декілька аспектів активності FOXP1, включаючи субклітинну локалізацію та транскрипційні репресивні властивості. Наші висновки вказують на важливість проведення функціональної характеристики, щоб допомогти виявити біологічну значимість варіантів, ідентифікованих геномними підходами, таким чином забезпечуючи розуміння шляхів, що лежать в основі складних розладів нейродевелопменту. Крім того, наші дані підтверджують гіпотезу, що варіанти de novo представляють значущі причинно-наслідкові фактори у важких спорадичних розладах і поширюють фенотип, що спостерігається у осіб з гаплонедостатністю FOXP1.

FOXP1 (білок вилки P1; OMIM 605515) належить до сімейства генів білка фактора транскрипції FOX, що визначається наявністю характерного домену, що зв’язує ДНК, відомого як вилка (FOX). 1 Ортолог миші Foxp1 необхідний для нормального розвитку серця, легенів та стравоходу 2, 3 і діє як доповнення до факторів транскрипції Хокса в регулюванні проекції та прикріплення рухових нейронів до м’язів-мішеней. 4, 5 Важливість Foxp1 у розвитку нейронів підкреслюється дослідженнями на мишах із специфічною для мозку делецією Foxp1. 6 У цих мишей-мутантів спостерігається порушення розвитку нейронів та аутична поведінка. В останні роки варіанти FOXP1 були зареєстровані у багатьох пацієнтів із спектральними розладами спорадичного аутизму (РАС), психічними вадами (ІД), загальною затримкою розвитку та середньою та серйозною затримкою мовлення, де експресивна мова найбільше постраждала (OMIM 613670)., 7, 8 Наявність мовленнєвих та мовних розладів як характеристика синдрому недостатності FOXP1 цікава, оскільки найбільш подібним геном FOXP1 є FOXP2, який порушується при рідкісних формах мовних та мовних розладів (OMIM: ген 605317, розлад 602081 ).,

Варіанти FOXP1, виявлені у пацієнтів з РАС та/або ІД, включають делеції цілих генів, 7, 9, 10, 11, 12 транслокацій, 13 варіантів безглуздості, 14 варіантів помилок 15 та варіанти зсуву рамки. 16 Виявлення делецій цілого гена свідчить про те, що механізмом патогенності є гаплонедостатність. Тяжкість фенотипу свідчить про те, що ці мутації не можуть передаватися у спадок, і у всіх випадках, коли тестували батьківську ДНК, виявляли варіанти de novo. За допомогою секвенування наступного покоління в цьому дослідженні ми виявили та охарактеризували de novo варіанти FOXP1 у дівчинки з тяжкою артеріальною гіпотензією, РАС та легким ІД з важкими порушеннями мови/мови.

Матеріали і методи

Клінічне секвенування екзоми

Клінічне секвенування екзоми пробанда та його батьків, що не постраждали, проводили в Центрі клінічної геноміки UCLA (детальний опис трубопроводу клінічної екзоми UCLA див. Lee et al 17). У пацієнта виявлено лише один високоякісний несинонімічний варіант кодування de novo, який впливає на ген FOXP1. Цей варіант послідовності мав показник якості ≥ 500, показів, що підтверджують альтернативний аллель у батьків, і ніколи не спостерігався серед загальної популяції (на основі проекту 1k Genomes Project, dbSNP135, NHLBI ESP). У пацієнта не виявлено клінічно значущих спадкових гомозиготних, гемізиготних, гомоплазматичних або комбінованих гетерозиготних варіантів.

Культура клітин та трансфекція

Живі клітини лімфобластів, трансформовані вірусом Епштейна-Барра, були отримані від батька, матері, пробанда та одного непостраждалого брата. Культури вирощували в RPMI-1640 (Лонза, Верв'є, Бельгія) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Клітини HEK293 вирощували в DMEM і SHSY5Y в DMEM-F12 (Invitrogen). До середовища додавали 10% фетальної бичачої сироватки (Invitrogen). Трансфекцію проводили за допомогою GeneJuice відповідно до інструкцій виробника (Merck-Millipore, Амстердам, Нідерланди).

Вилучення РНК та синтез кДНК

Загальну РНК екстрагували з імморталізованих лімфобластів за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Нідерланди), а першоцепочечну кДНК генерували з використанням високопродуктивного набору зворотної транскрипції кДНК (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія, США).

Розпад, опосередкований нісенітницею

Опосередковану безглуздя деградацію (NMD) оцінювали, як описано раніше. 16 кДНК FOXP1 ампліфікували за допомогою ПЛР з використанням прямих 5'-GTCTACAGAACCCAAAGCCGC-3 'і зворотних 5'-GGTTCTGCGCAATATCTGCTG-3' праймерів, з подальшим секвенуванням Сангера.

Кількісна RT-PCR

Кількісну RT-PCR проводили та аналізували, як описано раніше 18, використовуючи праймери, специфічні для ампліфікації FOXP1 c.1267_1268delGT (прямий 5'-CGTCACCCAAGGCCCCTCTC-3 '; зворотний 5'-TTGCGTCGGAAGTAAGCAAAC-3'), а потім послідовність Сангера.

Конструкції експресії ДНК та сайт-спрямований мутагенез

Дикий тип (WT) FOXP1 та FOXP2 ампліфікували за допомогою ПЛР та клонували у pCR2.1-TOPO (Invitrogen). 19 Варіант p.V423Hfs * 37 FOXP1 створено з використанням pCR2.1-TOPO.FOXP1 як шаблону з набором мутагенезу QuikChange II Site-Direct (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) та 5'-TGGTGGTTGTGATGAGAGGGGGGGG-3 'реверс 5'-CCCAAGGCCCCTCTCATCACAACCACCA-3 'праймери. КДНК FOXP субклоновані з використанням сайтів рестрикції BamHI/Xba I у pcDNA4HisMax, модифікований вектор pmCherry-C1 (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Франція), а також вектори експресії pLuc та pYFP. Всі конструкції були перевірені за допомогою послідовності Сангера.

SDS-PAGE та вестерн-блот

Клітини HEK293 трансфікували еквімолярними концентраціями експресійних плазмід FOXP1 і культивували протягом 48 годин. Лізис клітин, SDS-PAGE та вестерн-блоттінг проводили, як описано раніше. 19 мембран досліджували за допомогою Clontech мишачого анти-EGFP (для конструкцій pYFP) протягом ночі при 4 ° C з наступною інкубацією з кон'югованим HRP козячим антимишачим IgG протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (Bio-Rad, Veenendaal, Нідерланди). Пляки збирали і повторно перевіряли антитілом до β-актину Sigma для підтвердження того самого завантаження білка.

Флуоресцентна мікроскопія

Клітини HEK293 та SHSY5Y фіксували на покривному склі, як описано раніше. 19 злитих білків YFP та mCherry візуалізували за допомогою прямої флуоресценції, а ядра - за допомогою Hoescht 33342 (Invitrogen). Флуоресцентні зображення отримували за допомогою флуоресцентного мікроскопа Axiovert A-1 із програмним забезпеченням ZEN Image (Zeiss, Оберкохен, Німеччина).

Аналізи репортерів люциферази

Аналізи люциферази проводили, як описано раніше. 19

Біолюмінесцентний резонансний перенос енергії (BRET)

Аналізи BRET проводили, як описано раніше. 19, 20

Статистичне значення

Статистичну значущість репортерного аналізу люциферази аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та пост-хок-аналізу Тукі.

результат

Клінічний фенотип

Пацієнт - чотирнадцятирічна жінка, первістка дитини від батьків без судом. Її матері було 30 років, а батькові 32 роки. Вона народилася в кесаревому розтині через олігогідрамніон та прееклампсію, і при народженні виявили двомембранну пуповину та важку гіпотонію. Протягом першого року у неї були серйозні затримки руху; вона почала повзати з 12 місяців, а ходити з 20 місяців. У пацієнта також була затримка мови, перші слова почалися через 20 місяців. У віці 3 років у неї діагностували виразно-сприйнятливий розлад спілкування.

В даний час лише 50% мовлення пацієнта є когерентним і нездатним провести розмову. Зокрема, її виступ не має структури, має обмежений зміст і розподіл, і повторює прості фрази (ехолалія). Кращим способом зв'язку є надсилання повідомлень через електронний пристрій. Пацієнт провів погану оцінку мови: 50 балів за комплексну оцінку розмовної мови (

Повнорозмірне зображення

Обстеження з нормальними результатами включало генетичне тестування на м’язову дистрофію, мітохондріальні розлади, синдром крихкого Х та мікрочипи SNP. Електроенцефалографія та дослідження нервової провідності були нормальними. Магнітно-резонансна томографія, проведена у віці 12 років, виявила більше неінтенсифікуючих аномалій підкіркової та глибокої білої речовини та випадкову знахідку венозної ангіоми в лівій передній частці.

De novo варіант послідовності FOXP1, ідентифікований шляхом секвенування екзоми

У рідкісних випадках ASD останні підходи до виявлення генів були зосереджені на виявленні варіантів de novo шляхом використання секвенування повної екзоми у тріо батьків та дітей. Ця стратегія була успішною у виявленні значної частини популяційного ризику та у виявленні варіацій, що спричиняють відносно більші біологічні ефекти. 21 Для виявлення передбачуваних варіантів, які можуть впливати на функцію білка, ми, таким чином, провели клінічне секвенування екзоми 17 на ДНК пробандів та їх батьків, не впливаючи на це. Використовуючи цей підхід, ми ідентифікували гетерозиготну двоносну делецію у FOXP1, присутню в пробанді, яка згодом була підтверджена та підтверджена як нова за допомогою секвенування Сангера (рис. 1b). Варіант FOXP1 подано до бази даних NCBI ClinVar (//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; номер підключення ClinVar SCV000189225).

Цей варіант, c.1267_1268delGT (нумерований від першого кодуючого нуклеотиду в NM_032682.5), знаходиться в екзоні 15 FOXP1 (нумерований від NG_028243.1). Очікується, що зміна внесе фреймовий зсув у закодований білок, що призведе до передчасного припинення та втрати ДНК-зв'язуючого домену та сигналів локалізації ядер (NLS) (p.V423Hfs * 37, як рекомендує HGVS) (Рисунок 1c). У минулому повідомлялося про два потенційно збудливі гетерозиготні усічені варіанти FOXP1 у випадках ASD (c.1014_1015insA (p.A339Sfs * 4)) та ID (c.1573C> T (p.R525 *)) з мовою та дефіцит мови (див. рис. 1в для порівняння між трьома усіченими варіантами білка FOXP1).

Оскільки варіант вводить стоп-кодон перед останньою межею екзону в FOXP1, мутантна транскрипція може зазнати NMD. Тому ми оцінили експресію транскриптів FOXP1 у лімфобластах, отриманих із пробандів. В нормальних умовах культури клітин було виявлено, що експресується лише алель WT (рис. 1г). Після інгібування NMD можна виявити експресію як варіанта, так і алелів WT, що припускає, що транскрипти варіантів зазвичай погіршуються NMD (рис. 1г). Щоб визначити, чи не уникнув з цього процесу якийсь із варіантних транскриптів, ми провели кількісну RT-PCR з праймерами, специфічними для варіанта алеля FOXP1, і виявили, що c.1267_1268delGT FOXP1 експресується при низьких рівнях у лімфобластах, отриманих із пробандів (Рисунок 1е та додаткове зображення 1 ).

Функціональна характеристика варіанту послідовності FOXP1 у клітинах людини

Для вивчення ефектів варіантних транскриптів, що уникають NMD, ми провели функціональну характеристику білка, кодованого мутованим транскриптом. WT та варіанти форм FOXP1 експресувались як YFP- або mCherry-злиті білки в клітинах HEK293. Варіант білка p.V423Hfs * 37 експресувався на рівні, подібному до білка WT, як визначали вестерн-блот (рис. 2а). На відміну від FOXP1, який локалізувався в ядрі, варіант p.V423Hfs * 37 злився з mCherry, локалізованим у цитоплазмі, що відповідає втраті обох сигналів ядерної локалізації (рис. 2b). Слід зазначити, що коли варіант p.V423Hfs * 37 був злитий з YFP, він утворював агрегати в цитоплазмі (додаткова фігура 2). Подібні результати були отримані при дослідженні субклітинної локалізації варіанту FOXP1 у трансфікованих клітинах нейробластоми SHSY5Y людини (додаткова фігура 3). Відсутність домену, що зв’язує ДНК FOX, свідчить про те, що варіант FOXP1 навряд чи збереже свою здатність зв’язувати ДНК. Аналізи репортерів люциферази продемонстрували, що варіант p.V423Hfs * 37 не зміг придушити транскрипцію, що відповідає втраті здатності зв'язування ДНК (рис. 2в).

обговорення

Тут ми представляємо пацієнта з делецією 2-bp-делеції de FOXP1. Ця зміна призводить до деградації варіантних транскриптів та кодує нефункціональний білок, припускаючи, що фенотип пацієнта, ймовірно, є результатом гаплоінергії FOXP1. Далі ми демонструємо, що підмножина транскриптів варіанту FOXP1 витікає з ядра NMD та секвестрантів WT FOXP1 та FOXP2, припускаючи, що варіант p.V423Hfs * 37 може мати домінуючий негативний ефект при трансляції. У цьому випадку біологічні ефекти відбуватимуться завдяки поєднанню механізмів, головним патологічним механізмом є гаплоінформація. Майбутні дослідження нокдауну FOXP1 (наприклад, використання конструкцій shRNA) повинні бути інформативними для оцінки ефектів гаплонедостатності FOXP1 на молекулярному рівні.

Наш пацієнт поділяє кілька фенотипових характеристик з іншими особами, які носять варіанти FOXP1, що порушують функцію білка, включаючи аутизм, ідентифікацію, сильний дефіцит мови та макроцефалію. 7 Ці спостереження свідчать про те, що гаплонедостатність FOXP1 призводить до чіткого синдрому, що включає аспекти ІД та РАС, а також інші клінічні симптоми. 7 Тому цільовий скринінг на варіанти FOXP1 є обов’язковим для пробандів з клінічними характеристиками, що відповідають синдрому.

Незважаючи на те, що у нашої пацієнтки були порушені мова та мова, у неї не було дитячої мовної апраксії (труднощі з координацією складних послідовностей рухових м'язів ротової ділянки, необхідних для мови), і це є найважливішою особливістю у випадках патогенних мутацій FOXP2. 26, 27 У осіб з варіантами FOXP2 проблеми з артикуляцією мовлення супроводжуються порушеннями в декількох аспектах виражальної та перцептивної мови. 28, 29 У нашого пацієнта на більш виражену мову більше впливали, ніж на рецептивну мову, що відповідає фенотипам, що спостерігаються у інших осіб з варіантами втрати функції FOXP1. 7, 11, 14 Наразі не спостерігали варіантів FOXP1, які спричиняють порушення мови за відсутності більш глобальної когнітивної дисфункції. 30 Спостережувані відмінності між фенотипами гаплоінергії FOXP1 та FOXP2 можуть відображати відмінності в моделях нейронної експресії 23, 24 та/або регулюванні спільних та нерозподілених цілей за течією.

Наше дослідження надає додаткові докази того, що значна частина важких ізольованих розладів нервового розвитку може бути наслідком варіантів de novo. Далі це дослідження наголошує на важливості експериментальної характеристики варіантів, виявлених секвенуванням ДНК наступного покоління, для розуміння молекулярних та клітинних мереж, які є фундаментальними для основних порушень неврологічного розвитку.