скручуванням

  • предметів
  • реферат
  • мета:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • предметів
  • Дослідження експресії жирової тканини білого миші
  • Дослідження фракціонування та експресії білої жирової тканини людини
  • Культури первинних преадипоцитів
  • Вироблення, культивування та диференціація клітинних ліній преадипоцитів 3T3-L1
  • Виділення РНК та кількісна ПЛР зворотної транскрипції
  • Екстракція білка та вестерн-блот
  • Тест репортера Wnt-TCF4/LEF
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Експресія гена SFRP1 підвищується під час адипогенезу у людей та мишей
  • Надмірна експресія SFRP1 сприяє адипогенезу в преадипоцитах 3T3-L1 через інгібування сигналізації, залежного від Wnt/β-катеніну.
  • Sfrp1 регулюється у природніх умовах харчовий та метаболічний статус
  • Експресія SFRP1 в жировій тканині людини
  • обговорення
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова добавка в Інтернеті

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • диференціація
  • Метаболічний синдром
  • Ожиріння

реферат

Мережа передачі сигналів Wnt/ß-катеніну пропонує потенційні цілі для діагностики та відокремлення ожиріння від його метаболічних ускладнень. У цьому дослідженні ми досліджували роль антагоніста Wnt, що секретує пов'язаний з креветками білок 1 (SFRP1), у сприянні адипогенезу in vitro та розширенню жирової тканини in vivo.

методи:

Комбінація моделей адипогенезу in vivo та in vitro людини та миші, розширення жирової тканини та метаболічного синдрому, пов’язаного з ожирінням, використовується для профілактики залучення SFRP1.

результати:

SFRP1 експресується як в мишачих, так і в зрілих адипоцитах людини. Експресія SFRP1 індукується під час адипогенезу in vitro, і SFRP1 переважно експресується у зрілих адипоцитах у жировій тканині людини. Конститутивна ектопічна експресія SFRP1 є проадіпогенною та інгібує сигнальний шлях Wnt/β-катеніну. Ендогенні рівні жиру SFRP1 in vivo регулюються відповідно до проадіпогенних умов. Однак під час поздовжніх досліджень мишей з високим вмістом жиру ми спостерігали динамічну тимчасову, але двофазну регуляцію ендогенного SFRP1. Відповідно до цього профілю ми спостерігали, що експресія SFRP1 в тканинах людини є найвищою у пацієнтів із легким ожирінням і поступово зменшується у осіб із патологічним ожирінням.

висновок:

Наші результати свідчать про те, що SFRP1 є ендогенним модулятором сигналізації Wnt/β-катеніну і бере участь у паракринній регуляції адипогенезу людини. Зниження експресії жиру SFRP1 при патологічному ожирінні та його ефект, що запобігає подальшому розширенню жирової тканини, може сприяти розвитку метаболічних ускладнень у цих осіб.

Ожиріння пов'язане з більш високим ризиком розвитку хронічних захворювань, таких як серцево-судинні захворювання, діабет II типу, атеросклероз та так званий метаболічний синдром. 1, 2 Незважаючи на покращення обізнаності громадськості, політику сприяння змінам способу життя та науковий успіх у розкритті механізмів, що регулюють енергетичний баланс, поширеність ожиріння продовжує зростати. Сучасні прогнози говорять про те, що за епідемією ожиріння настане друга хвиля руйнівних серцево-судинних ускладнень. Тому, паралельно із зусиллями щодо боротьби з ожирінням, більш прагматичний підхід передбачає, що зусилля повинні бути зосереджені на відокремленні ожиріння від кардіометаболічних ускладнень.

Хоча, здавалося б, протидіють інтуїції, стратегії, що збільшують здатність жирової тканини зберігати ліпіди і, отже, збільшують індивідуальне ожиріння, можуть мати метаболічні переваги. Дозвіл жировій тканині зберігати більше ліпідів може запобігти вторинним метаболічним ускладненням, спричиненим зберіганням ліпідів у нежирових органах. Концепція корисного розширення жирової тканини підтверджується очевидним парадоксом, що дефіцит жирової тканини призводить до ліподистрофії, і це також повторює багато особливостей метаболічного синдрому. В цілому, цілком ймовірно, що існує оптимальний діапазон загальної маси жирової тканини тіла, за яким розвивається порушення метаболічної регуляції. У зв'язку з цим здатність жирової тканини розширюватися та пристосовуватися до потреби накопичувати надлишок енергії може бути ключовим фактором, що визначає сприйнятливість до розвитку метаболічного синдрому, пов'язаного з ожирінням. 1, 2, 3, 4 Розуміння факторів сигналізації, які контролюють процес розширення титрованої жирової тканини, є основою раціонального підходу до розробки ефективних методів лікування для профілактики та лікування метаболічного синдрому. 5

Сімейство секретованих факторів росту Wnt діє паракринно та/або аутокринно і, як відомо, контролює диференціацію адипоцитів. 6, 7, 8, 9 Сигналізація Wnt спирається на складну регульовану мережу, здатну забезпечити контекстну відповідь залежно від контексту. Коротко кажучи, зв'язування специфічних білків Wnt із рецепторами Frizzled трансдукує внутрішньоклітинні сигнали або шляхом, залежним від β-катеніну, або шляхами, що не залежать від β-катеніну. Хоча обидва шляхи можуть бути активними в преадипоцитах10, це перший, який найкраще охарактеризувати та показати, що він сильно пригнічує адипогенез in vitro та in vivo. 8, 9 У залежному від β-катеніну шляху активація рецепторів призводить до стабілізації та накопичення цитозольного β-катеніну. Потім Β-катенін транслокується в ядро, де він зв’язується та активує специфічні фактори транскрипції лімфоїдного енхансеру/Т-клітинного фактора (LEF/TCF). Гени-мішені Wnt/TCF включають циклін D1, Id2 та c-myc, які інгібують адипогенез. 11, 12

Матеріали і методи

предметів

Експресія SFRP1 під час адипогенезу у людей та мишей. a ) Рівні мРНК SFRP1 людини, нормалізовані до рівнів 18S рРНК, вимірювали за допомогою RT-PCR у реальному часі в зазначені години диференціації первинних культур SVF людини (групи А). * P ** P *** P ** P * P ** P * P ** P *** P 23 Всі протоколи на тваринах, використані в цьому дослідженні, були схвалені Міністерством внутрішніх справ Великобританії та Кембриджським університетом.

Дослідження фракціонування та експресії білої жирової тканини людини

Виділення людських адипоцитів та преадипоцитів проводили на зразках, отриманих від суб'єктів групи А, як описано раніше. 12, 23 Коротко, біопсії жирової тканини поміщали в забуференний фосфатом сольовий розчин (Sigma-Aldrich, Дорсет, Англія) та обробляли протягом 30 хвилин. Зразки акуратно нарізали кубиками і переварили у розчині колагенази (збалансований сольовий розчин Хенка, що містить 3 мг мл-1 колагенази типу II (Sigma-Aldrich) та 1,5% бичачого сироваткового альбуміну) при 37 ° С протягом 1 години. Згодом розчин для травлення фільтрували через сітку з нержавіючої сталі і центрифугували при 400 g протягом 5 хвилин для відділення зрілих адипоцитів від стромальних судинних клітин.

Культури первинних преадипоцитів

Для виділення людських преадипоцитів зразки жирової тканини людини отримували у суб'єктів групи А. Первинні преадипоцити мишей виділяли з білої жирової тканини епідидиму (WAT) 6-тижневих самців мишей C57B/6, як описано раніше. 24 Первинні культури людини та мишей диференціювали через 3 дні після злиття, додаючи модифіковану Дульбекко середовище Ігл/шинку F12 з 33 мкмоль 1 -1 біотину, 17 мкмоль -1 пантотенової кислоти, 10 мкг мл -1 апотрансферину, 0,2 нмоль л - 1 трийодтиронін, 100 нмоль 1 -1 кортизолу та 500 нмоль 1 -1 інсуліну. Протягом перших 3 днів культивування до середовища також додавали 0,25 ммоль 1-1-1-метил-3-ізобутилксантину (IBMX). Середовище диференціації змінювали через 3 дні при першій можливості, а потім кожні 2 дні.

Вироблення, культивування та диференціація клітинних ліній преадипоцитів 3T3-L1

Виділення РНК та кількісна ПЛР зворотної транскрипції

Підготовка РНК, зворотна транскрипція та умови ПЛР TaqMan в режимі реального часу для зворотної транскрипції виконувались, як описано раніше: див. Christodoulides et al. 12 та Lagath та ін. 23 для групи A, Ortega et al. 21 для групи B та Pietilainen et al. 22 для групи C. Праймери або зонди були придбані у Perkin Elmer (Кембридж, Великобританія) або розроблені за допомогою програмного забезпечення Primer Express (Applied Biosystems, Чешир, Великобританія) та послідовностей з бази даних GenBank.

Екстракція білка та вестерн-блот

До аналізу білків методом вестерн-блоттінгу середовище видаляли і клітинні моношари промивали крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом, а потім заморожували в рідкому азоті. Їх розморозили на льоду та зішкребали в буфер для лізису, як описано вище при 4 ° С. Білки електроблотували на нітроцелюлозну мембрану (Amersham Biosciences, Piscataway, Нью-Джерсі, США). Специфічні білки виявляли інкубацією з відповідними первинними антитілами та кон'югованими з пероксидазою хрону вторинними антитілами. Імунні комплекси виявляли підвищеною хемілюмінесценцією (Amersham Biosciences).

Тест репортера Wnt-TCF4/LEF

Для аналізу репортерів TCF4 клітини SFRP1 та порожній вектор (EV) 3T3-L1 вирощували до злиття, а аналізи промотора-репортера Topflash-reporter проводили, як описано раніше. 12

Статистичний аналіз

Надмірна експресія SFRP1 сприяє адипогенезу в преадипоцитах 3T3-L1 через інгібування сигналізації, залежного від Wnt/β-катеніну.

SFRP1 є антагоністом передачі сигналів Wnt/β-катеніну в адипоцитах 3T3-L1. Преадипоцити були інфіковані ретровірусом, що несе людський SFRP1 або вектор (EV). a ) Рівні мРНК SFRP1, нормалізовані до рівнів 18S рРНК, вимірювали за допомогою RT-PCR у реальному часі на 0-й день та день диференціювання в клітинах, що експресують SFRP1 та EV. * P *** P * P ** P *** P -1) протягом 48 годин. Результати виражаються кратною різниці від EV. Результати повідомляються як середнє значення ± sem щонайменше трьох незалежних експериментів, проведених у трьох примірниках. * P ** P

SFRP1 сприяє адипогенезу в преадипоцитах 3T3-L1. ( a ) Клітини SFRP1 та EV 3T3-L1 диференціювались чи ні (-) за субмаксимальних умов: IBMX (M) окремо або дексаметазон та інсулін (DI) або з повним диференційованим коктейлем (MDI). Клітини фарбували маслом Red-O для візуалізації крапель ліпідів через 8 днів після індукції. Фарбування кількісно визначали при 540 нм і виражали у відсотках від EV (-). * P *** P * P ** P

Sfrp1 регулюється харчовими сигналами, генетичним ожирінням та метаболічним статусом in vivo. Рівні мРНК Sfrpl, нормалізовані до 18S рРНК, вимірювали в ( a ) по всій епідидимальної жировій тканині і ( b ) зрілі адипоцити від 8-тижневих самців мишей C57/B16, яких стимулювали за таких умов: годували (n = 8-9), голодували (24 год) (n = 7-8) та голодували (24 год) (n = 7–8). * P ** P *** P ** P *** P * P 23 Що ще важливіше, це збільшення розтяжності жирової тканини було пов’язане із суттєво підвищеним рівнем Sfrp1 (рис. 4f).

Загалом, ці спостереження дозволяють припустити, що in vivo рівні мРНК WAT Sfrp1 підвищені, коли є потреба у накопиченні жиру та розширенні жирової тканини; висновок, який відповідає його ролі in vitro у сприянні рекрутингу та дозріванню нових адипоцитів. Однак це збільшення Sfrp1, здається, не є стійким, незважаючи на підтримку позитивного калорійного балансу та попиту на накопичення жиру. Це говорить про те, що SFRP1 може бути корисним маркером і підтримує існування верхньої фізіологічної межі, в межах якої запаси жиру можуть розширюватися і накопичувати ліпіди. Цікаво, що зниження рівня Sfrp1 через 6 місяців HFD пов’язане з розвитком метаболічних ускладнень.

Експресія SFRP1 в жировій тканині людини

Регуляція SFRP1 в жировій тканині людини. a ) Рівні мРНК SFRP1, нормалізовані до циклофіліну А, у підшкірній жировій клітковині 31 білої європейської жінки (група В). Для всіх суб'єктів межа ІМТ визначається відповідно до класифікації ВООЗ (ІМТ 40, n = 12). Дисперсійний аналіз (ANOVA) не досяг статистичної значущості, P = 0, 059. ( b ) Експресію мікрочипів SFRP1 вимірювали в підшкірній жировій тканині 13 пар монозиготних близнюків, що не розходяться у вазі (група С). Парний t-тест, ** P = 0,005.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Наша група, разом з іншими, раніше показала, що сигнальний шлях Wnt/β-катеніну може регулювати адипогенез in vitro та in vivo (оглянуто в Prestwich and Macdougald 8 and Christodoulides et al. 9). Багато з цих досліджень були зосереджені на генетичних та/або фармакологічних маніпуляціях із сигнальними компонентами Wnt/β-катеніну на моделях мишей. Однак нещодавно ми прагнули розширити це дослідження, щоб краще зрозуміти роль ендогенної сигналізації Wnt у пластичності жирової тканини у гризунів та людей. Нещодавно ми представили харчовий регульований ген преадипоцитів Dact1, який сприяє адипогенезу через скоординований вплив на експресію генів. Це призводить до селективної зміни як внутрішньоклітинного, так і паракринного/аутокринного компонентів сигнального шляху Wnt/β-катеніну. 23 Крім того, експресія та активність мережі передачі сигналів Wnt/β-катеніну, здається, залежать від контексту та виду, адже деякі компоненти, такі як Dkk1, експресуються в жировій тканині людини, але не в моделях мишей. 12

Тут ми показуємо, що SFRP1 може також бути важливим позаклітинним модулятором сигналізації Wnt/β-катеніну і сам регулюється під час адипогенезу та ожиріння. Ми показали, що SFRP1 динамічно регулюється під час адипогенезу як людини, так і миші, а також сприяє диференціації адипоцитів in vitro. Проадіпогенна роль SFRP1 відповідає зменшенню ожиріння мишей з нульовим SFRP1. Що ще важливіше, ми також надаємо докази того, що ендогенний SFRP1 гостро регулюється у відповідь на багаторазове введення та короткочасний HFD in vivo у WAT. Це робить SFRP1 сильним кандидатом, який сприяє реакції титрованої жирової тканини на короткочасні харчові проблеми. Однак наші дані також підтверджують думку, що та сама гомеостатична система, яка регулює розширення та функціонування жирової тканини, обмежена і може призвести до хронічного надлишку поживних речовин, як це виявляється при хворобливому ожирінні. На додаток до встановленої межі маси жирової тканини, здатність до подальшого розширення жирової тканини вичерпується, що, на наш погляд, призводить до метаболічних ускладнень, пов’язаних із ожирінням.

Незважаючи на добре встановлену роль передачі сигналів Wnt/β-катеніну під час адипогенезу in vitro та in vivo, важливим аспектом, який залишається менш добре охарактеризованим, є те, що однакові сигнали відіграють роль у регуляції маси жирової тканини людини. Ми показуємо, що ендогенний SFRP1 також регулюється в жировій тканині людини і що він переважно експресується в адипоцитах. Наші дослідження поперечного перерізу також дозволяють припустити, що експресія SFRP1 може мати двофазний профіль в жировій тканині людини, подібний до того, що спостерігається у гризунів. Зокрема, експресія жирового SFRP1 у людей збільшується у осіб, що мають легке ожиріння (ІМТ від 25 кг м-2 до 30 кг м-2), а потім поступово зменшується під час розвитку у напрямку до захворюваного ожиріння. Зрозуміло, що для повного підтвердження цієї моделі у людей потрібно буде проспективне дослідження, яке в даний час неможливо.

При ожирінні резистентних до інсуліну станах відбувається локалізоване запалення жирової тканини, що може допомогти обмежити подальше розширення жирової тканини. Дійсно, ми та інші показали, що прозапальні цитокіни, виявлені в резистентних до інсуліну станах, можуть погіршити адіпогенез, збігаючись із сигналами Wnt/β-катеніну. 11, 26 Також є дані про знижену адипогенну здатність при ожирінні людини. 27, 28, 29 Підвищені запальні цитокіни, виявлені в інсулінорезистентних умовах ожиріння, можуть надати пояснення зниженого рівня SFRP1, виявленого у мишей C57B16, яких годували HFD протягом 6 місяців. Для підтвердження цієї взаємозв'язку у ВАТ людини було б необхідно мати доступ до жирової тканини пацієнтів з важким ожирінням з необробленим та/або неконтрольованим діабетом. Однак це не виключає можливості того, що, здавалося б, "нормальний" рівень SFRP1, який спостерігається при патологічному ожирінні, слід вважати непропорційно низьким з точки зору ступеня жирового розширення цих осіб. У зв'язку з цим ці невідповідні рівні SFRP1 можуть відображати біологічну межу, до якої ці особи можуть розширювати свої запаси жиру.

Передбачувана роль SFRP1 у пластичності жирової тканини.

Повнорозмірне зображення

Підводячи підсумок, ми визначили і охарактеризували роль SFRP1, секретованого інгібітора передачі сигналів Wnt, як визначального фактору розтяжності жирової тканини. Майбутні дослідження з використанням більших когорт можуть надати докази його корисності як показника ризику метаболічних ускладнень, пов’язаних із ожирінням. Разом наші дані підтримують концепцію максимальної здатності до розширення жирової тканини і надалі вказують на сигналізацію Wnt як важливий модулятор розтяжності жирової тканини з можливим терапевтичним використанням при лікуванні метаболічних ускладнень, пов’язаних із ожирінням.