народженні

  • реферат
  • мета:
  • дизайн:
  • розміри:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • Матеріали і методи
  • Ожиріння матері
  • Відбір проб
  • Вимірювання лептину та інсуліну в плазмі крові
  • Кількісна ПЛР в режимі реального часу
  • Статистичні методи
  • результат
  • обговорення

реферат

Основні регулятори апетиту та їх рецептори вже присутні в гіпоталамусі плода і можуть реагувати на такі гормони, як лептин. Обмеження внутрішньоматкової дієти або гіперглікемія можуть перепрограмувати ці схеми, що, ймовірно, призведе до несприятливих наслідків для здоров'я в зрілому віці. Через глобальну епідемію ожиріння переважають надмірна вага та ожиріння матері. Раніше ми спостерігали швидкий ріст дитинчат матерів, що страждають ожирінням, під час годування груддю. Однак незрозуміло, чи це пов’язано зі зміною регуляторів апетиту до лептину та гіпоталамуса при народженні.

дизайн:

Самки щурів Спрег-Доулі годували смачною дієтою з високим вмістом жиру (HFD) або чау протягом 5 тижнів, щоб викликати ожиріння перед спаровуванням. Така ж дієта тривала і під час вагітності. На 1-й день, після народження, плазму та гіпоталамус збирали у самців та самок щенят.

розміри:

Фіксували масу тіла та масу органів. Рівні лептину та інсуліну у плазмі крові вимірювали радіоімуноаналізом. Експресію мРНК гіпоталамуса нейропептиду-Y (NPY), про-опіомеланокортину, рецептора лептину та його нижчого сигналу, STAT3 (перетворювача сигналу та активатора транскрипції 3), вимірювали за допомогою ПЛР у реальному часі.

результати:

Вага тіла та органів цуценят від повних матерів був подібний до ваги бідних матерів обох статей. Однак рівні лептину в плазмі крові були значно нижчими у нащадків матерів із ожирінням (чоловіки: 0,53 ± 0,3 проти 1,05 ± 0,21 нг мл -1; жінки: 0,33 ± 0,09 проти 2,12 ± 0,57 нг мл -1, як Р 1 Розвиток та дозрівання цих шляхів залежить від збільшення лептину, яке відбувається між постнатальними 6-14 днями, що характеризується раптовим підвищенням рівня лептину в крові.

Лептин, який також називають "білком ob", виробляється переважно адипоцитами, і ранній початок ожиріння очевидний за відсутності білка лептину або його рецептора. 3 Ключова форма сигналізації, довга форма рецептора лептину (Ob-Rb), знаходиться в гіпоталамічних областях, що беруть участь в апетиті та метаболічній регуляції. 4 Внутрішньоклітинний домен Ob-Rb зв'язується зі STAT3 (перетворювачем сигналу та активатором транскрипції 3), щоб індукувати експресію інгібітора сигналізації, SOCS3 (супресор сигналізації цитокінів3). 4 У дорослих гризунів лептин знижує рівень, викликаний гіперфагією, і зменшує нормальне щоденне споживання їжі, масу тіла та накопичення жиру.) Та транскрипцію, регульовану кокаїном та амфетаміном. 5

Однак у гризунів, що попередньо відлучені, лептин відіграє іншу роль, ніж у дорослих тварин, і, здається, не залежить від його ролі в енергетичному гомеостазі. 2, 6 Екзогенний лептин не зменшує масу тіла, споживання молока або швидкість метаболізму протягом перших двох постнатальних тижнів7, але насправді може сприяти добровільному харчуванню та гіперфагії в цей період. Це важливо, оскільки новонароджені гризуни повинні максимізувати споживання їжі, а також підтримувати високий рівень метаболізму терморегуляції для виживання. Диференціація нервових систем, що регулюють апетит та витрати енергії, завершується до відлучення. 1 Підвищений циркулюючий лептин під час "росту лептину" сприяє розвитку та дозріванню центральних нейронів, що беруть участь у регуляції апетиту та енергетичному обміні. 2 Дефіцит лептину у мишей ob/ob призводить до зниження щільності та іннервації нейронального гіпоталамуса, що, як вважають, сприяє фенотипу ожиріння. 6, 9 Показано, що високий постнатальний "ріст лептину" через обмежене внутрішньоутробне харчування пов'язаний із підвищеною експресією гіпоталамічного пептиду NPY, який може бути відповідальним за збільшення ваги та ожиріння, коли тварин годують з високим вмістом жиру. дієта (HFD) після відлучення від грудей. 10

Внутрішньоматкове середовище відіграє важливу роль у подальшому житті у розвитку плода та у визначенні ризику ожиріння та порушень обміну речовин, таких як непереносимість глюкози та гіпертонія. На сьогоднішній день внутрішньоутробний ріст, пов’язаний з недоїданням та підвищеним ризиком ожиріння, був ретельно вивчений. Однак, враховуючи глобальну епідемію ожиріння, необхідно розуміти вплив переїдання матері на гіпоталамусові ланцюги плода, що беруть участь в енергетичному гомеостазі. Збільшується кількість жінок, які вступають у вагітність, страждають від надмірної ваги або ожиріння. 12 Дитяче ожиріння пов'язане з внутрішньоутробним недоїданням, обумовленим ожирінням матері. Кілька лабораторій вивчали нейроендоциновий ефект ожиріння матері внаслідок тривалого годування HFD потомством. 13, 14

Раніше ми спостерігали, що потомство матерів з ожирінням народжувалося з такою ж масою тіла, як і худорлявих матерів, тоді як їх збільшення ваги прискорювалося незабаром після народження і стало значно складнішим після 10-го дня після пологів, ніж у бідних матерів. 13, як внутрішньоутробне переїдання внаслідок годування материнським ВЧР, перепрограмує метаболізм, особливо регулятори апетиту гіпоталамуса у цуценят, щоб сприяти зростанню незабаром після народження. Тому ми висунули гіпотезу, що на 1-й день життя щенята, народжені від повних матерів, мали б підвищену експресію лептину в плазмі та гіпоталамусу NPY, але зниження експресії мРНК POMC, сприяло збільшенню споживання молока, що призвело до швидкого зростання відразу після народження.

Матеріали і методи

Ожиріння матері

Дівочі щури Спрег-Доулі (віком 8 тижнів, Центр тваринницьких ресурсів, Перт, Австралія) утримувались при 20 ± 2 ° C і підтримували 12:12 годинний цикл світло/темрява (світло ввімкнено протягом 6 годин). Щурів класифікували на дві групи з подібною середньою масою тіла. Контрольну групу піддавали стандартним лабораторним кормам (Gordon's Special Stockfeeds, NSW, Австралія), які забезпечували 11 кДж г -1 (14% енергії у жировій формі), хоча друга група отримувала смачне HFD кафе, що забезпечує 15, 33 кДж g -1 (34% енергії у вигляді жиру). Коротше кажучи, HFD складався з модифікованих кормів з високим вмістом жиру (стандартна дієта, сухе молоко, підсолоджене згущене молоко та насичені тваринні жири) та смачних страв у стилі кафе, таких як тістечка та печиво (4-5 різних видів їжі на день ) .з відомою калорійністю. Щодня подавали свіжу їжу. Самки щурів піддавались дієті або HFD протягом 5 тижнів перед спарюванням з самцями щурів (віком 9 тижнів), отриманими з того ж джерела. Це дослідження було схвалено Комітетом з етики тварин при Університеті Нового Південного Уельсу.

Відбір проб

У перший день після народження цуценят обох статей відокремили від матерів і негайно вбили шляхом обезголовлення. Збирали стовбурову кров і вимірювали рівень глюкози в крові (глюкометр Accu-Chek; Roche Diagnostics, Натлі, Нью-Джерсі, США). Відокремлену плазму зберігали при -20 ° C для вимірювання гормонів. Весь гіпоталамус розтинали та швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C для визначення експресії мРНК бажаних генів. Серце, печінку та шлунок розтинали та зважували.

Вимірювання лептину та інсуліну в плазмі крові

Концентрації лептину та інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів для радіоімунологічного аналізу (Linco, MO, USA) відповідно до інструкцій виробника. Межі виявлення лептину та інсуліну становили 0, 125 та 0,05 нг/мл -1 .

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Загальну РНК виділяли з окремих чоловічих та жіночих гіпоталамусів за допомогою реагенту TriZol (Invitrogen Australia Pty. Ltd., Мельбурн, Вікторія, Австралія) відповідно до інструкцій виробника. Очищену загальну РНК використовували як шаблон для генерування синтезу кДНК першої ланцюга з використанням зворотної транскриптази M-MLV, РНКази Н мінус, набору точкових мутантів (Promega, Madison, WI, США). Зонди/праймери Applied Biosystem (Applied Biosystem, Каліфорнія, США) використовувались для кількісної ПЛР в режимі реального часу (Eppendorf Realplex 2, Eppendorf AG, Гамбург, Німеччина) та були попередньо оптимізовані та перевірені. Послідовність зондів, наданих виробником, наведена в таблиці 1. Зонди цільових генів позначали FAM (6-карбоксифлуоресцеїн), а 18 с рРНК мітили VIC. Таким чином, експресія генів була кількісно визначена за допомогою простої мультиплексної реакції, де наш цікавий ген стандартизували до побутового гена (18 с рРНК). Потім окрему пробу з контрольної групи довільно призначали як калібратор, по відношенню до якої всі інші зразки виражали кратним різниці.

Стіл в натуральну величину

Статистичні методи

Результати виражаються як середнє значення ± sem. Дані аналізували за допомогою тесту на нормальність Шафаріо Вілкса (Graphpad Prism 5). Якщо дані розподілялись у звичайному режимі, їх аналізували за допомогою неспареного t-критерію Стьюдента. Якщо ні, журнали перетворювались на звичайний розподіл, а потім аналізувались неспареним t-критерієм Стьюдента.

результат

До початку дієтичного втручання ваги тіла були однаковими між групами жінок (183,0 ± 3,8 г годували проти 183,9 ± 4,3 г годували HFD). До спаровування самки щурів, яких годували HFD, були на 29% важчі, ніж щури, яких годували їжею (295, 2 ± 11, 1 г проти 229,5 ± 7,54 г, Р

Гіпоталамічний NPY ( a ), AgRP ( b ), mTOR ( c ), POMC ( d ) та MC4R ( e ) експресія мРНК у чоловічих дам-чоу (відкритих барах n = 6) та HFD (закритих барах n = 5)). Результати виражаються як середнє значення ± sem. Дані аналізували неспареним t-критерієм студента. * P

Гіпоталамічна експресія Ob-Rb ( a ), STAT3 ( b ) та SOCS3 ( c ) мРНК у чоловіків, що харчуються (відкриті бари n = 6) та HFD (закриті бари n = 5). Результати виражаються як середнє значення ± sem. Дані аналізували неспареним t-критерієм студента. * P

Гіпоталамічний NPY ( a ), AgRP ( b ), mTOR ( c ), POMC ( d ) та MC4R ( e ) вираз у щенятах дам чоу- (відкриті колонки n = 6) та HFD (закриті колонки n = 6). Результати виражаються як середнє значення ± sem. Дані аналізували неспареним t-критерієм студента. * P

Новонароджені з високим або низьким рівнем лептину при народженні мають вищий ризик розвитку ожиріння та діабету 2 типу порівняно з тими, хто має нормальний рівень лептину. 21, 30 Ми виявили, що цуценята від повних матерів набирали більшу вагу під час лактації та зберігали жирову тканину швидше, ніж цуценята худорлявих матерів після народження, що призвело до 10-кратного збільшення маси заочеревинного жиру на 7 день після пологів. У цей час рівень лептину в плазмі крові був підвищений порівняно з молодими матерями (неопубліковані дані), що може бути пов’язано з більш багатим грудним молоком або збільшенням маси жиру. 28 Збільшення ожиріння та рівня лептину в циркуляції у нащадків матерів із ожирінням зберігалося до 20-го дня після пологів. 13

Після народження грудне молоко починає розщеплювати лептин, а при диференціації адипоцитів ендогенна продукція лептину у цуценят також наздоганяє. Чи надмірно це компенсується і чи спричиняє більш високе збільшення лептину, що призводить до більш швидкого зростання протягом періоду лактації, подальше дослідження. Іншим важливим питанням є те, чи зберігаються ці пристосування гіпоталамусу до ожиріння матері протягом тривалого часу. Однак наші результати показують, що значні зміни в основних регуляторах гіпотетичного апетиту на 1 день після пологів зумовлені ожирінням матері, що може сприяти переїданню щенят. Низький рівень лептину новонароджених у плазми мишей з дефіцитом лептину та після зменшення внутрішньоутробного харчування щурів призводив до порушення розвитку нервів під час лактації та ожиріння дорослих, 46, 47, тоді як введення лептину в ранній постнатальний період покращувало фенотип ожиріння. 48. припускає, що раннє поповнення лептину після народження може змінити шкідливий вплив ожиріння матері на потомство.